烟草光独立组织培养的初步研究

摘要：本研究以烟草为试验材料，探讨了糖含量、透气孔等因素对烟草光独立组织培养的影响。结果表明，在无糖有气孔的组培条件下，烟草叶片具有一定的出愈率和出芽率，烟草试管苗生长健壮、根系发达。本研究为建立烟草光独立组织培养体系奠定了基础。

关键词：烟草；光独立培养；无糖培养

植物光独立组织培养，又称无糖组织培养，是一种新型的植物组织培养技术[1]。它与传统组织培养方法的主要区别在于[2]：①使用不含糖的培养基，以CO2作为植物的碳源，可以大幅度减少污染率；②通过控制影响试管苗生长的环境因子，促进植株光合速率，使试管苗由异养型转变为自养型，以更接近植物自然生长状态，生根率和成苗率显著提高；③培养可以转入一种较大的容器中进行，直至进行开放式、暴露式培养。

烟草是一种重要的经济作物。烟草通过有性繁殖获得的种苗易发生变异，而且易感病毒，造成品质退化，从而影响经济效益。而通过组织培养技术可以获得脱毒苗，保持烟草优良品种的性状。本研究通过以烟草为试验材料，探讨糖含量、透气孔等因素对植物组织培养的影响，以建立烟草光独立组织培养体系。

1 材料与方法

1.1 材料

普通烟草（Nicotiana tabacum L.）。

1.2 培养基

（1）愈伤诱导及芽分化培养基（简称诱导培养基）： MS + Agar 0.8% + 2，4-D 0.5 mg/L+ 6-BA 1.0 mg/L；（2）生根培养基：MS + Agar 0.8%+ NAA 0.2 mg/L。

1.3 实验方法

1.3.1培养条件 培养温度25±2℃，光照14h/d，光照强度3 000lx。采用改变蔗糖含量、有无透气孔等培养条件来研究光独立培养技术。其中，组培瓶透气孔的直径为1cm。

1.3.2 愈伤组织诱导及不定芽分化 取烟草幼嫩叶片洗净后，用70%乙醇消毒30s，0.1%升汞浸泡10min，无菌水冲洗5～6 次后，将叶片切成0.5cm×0.5cm 的小块，接入诱导培养基中进行培养。观察不同培养条件下外植体变化，培养2w后，记录愈伤大小和出愈率。4w后，记录芽诱导率（芽数/块愈伤组织）。

1.3.3 诱导生根及移栽 取约2cm长，具有2片叶子的无根小苗（不定芽）接种于生根培养基中，2w后观察不同培养条件下的生根率、叶片数、株高和长势。当试管苗长至5～6cm 高时，开瓶盖培养2d后取出，移栽到泥土盆。

2 结果与分析

2.1 无糖培养对烟草愈伤组织诱导和分化的影响

外植体叶片接入诱导培养基约2～3d 后，叶片卷曲、增厚、膨胀，2w后外植体形成疏松膨大的浅黄绿色的愈伤组织。4w后，从愈伤组织上分化出许多浅黄绿色芽点。不同培养条件对烟草愈伤组织诱导和分化的影响结果见表1。

在含糖培养条件下，无论有无透气孔，形成的愈伤块均较大，诱导率均达100%。4w后的芽诱导率分别为5.5、4.3。在无糖培养时，有无透气孔对愈伤诱导影响很大，有气孔培养的愈伤较大，诱导率较高，可达53.3%，无气孔条件下，外植体卷曲但膨胀不明显，出愈率只有6.7%。有气孔的出芽率为2.8，无气孔的出芽率为0。

表1 不同培养条件对烟草愈伤组织诱导和分化的影响

2.2 无糖培养对烟草小植株生长的影响

无根小苗接种于生根培养基后，外植体开始从其基部产生白色幼根， 叶片增多，植株长高。不同培养条件对烟草小植株生长的影响结果见表2。

由结果可知，含糖培养基中生根率达100%，叶片和株高增加明显，长势健壮，但根系较短。在无糖培养时，生根率有所下降，有气孔的生根率较高，达到76.7%，无气孔的仅为43.3%。从试验中观察到， 不论培养基有糖还是无糖，有气孔培养的植株颜色鲜绿，根系较发达，无气孔培养的植物颜色较浅，尤其是无糖无透气孔培养的试管苗呈水渍状，瘦弱，叶片发黄，部分死亡。

表2 不同培养条件对烟草小植株生长的影响

3 讨论

光独立培养主要是利用植株的光合作用，提高自养生长能力。由于离体培养的外植体仍然含有叶绿体，在CO2 浓度及光照适当时， 培养瓶内的小植株仍然也可以通过光合作用而自我生长[1]。但是在相对密闭的培养瓶中CO2浓度很低，通常小于空气中的CO2浓度，这时小植株的光合作用被抑制[2]。利用透气孔可使培养瓶中CO2浓度升高，到达空气中的CO2浓度水平，这时就可促进小苗生长。因此有气孔的培养条件对无糖培养非常重要。

本研究在以烟草叶片为外植体诱导愈伤组织时，发现叶片对糖的依赖性很高，含糖培养基更有利于叶片愈伤诱导和出芽，但在有气孔的条件下，无糖培养也可以获得一定的出愈率和出芽率。在以烟草不定芽为外植体进行试管苗培养时，无糖有气孔培养的小植株虽然生根率略低，但试管苗颜色鲜绿，根系发达，移栽更容易存活。烟草的光独立培养可以通过改变透气孔、光强等培养条件而得到优化，从而使光独立培养技术更具应用价值。

参考文献

[1] Kozai T，Kitaya Y，Kutota C.Collected Papers on Environmental Control in Micropropagation Volume 3.Japan：Chiba University Press，1995：591-947.

[2] 杨武振，王荔，侯典云等.无糖组织培养技术研究进展[J].云南农业大学学报，2004，19（3）：239-242.

作者简介：鲁梦婷，女，浙江余姚人，中国计量学院现代科技学院本科生。

通讯作者：徐晓晖，男，浙江永康人，中国计量学院现代科技学院副教授，从事生物技术教学与研究工作。