丹参类贝壳杉烯氧化酶(SmKOL)基因全长克隆及其生物信息学分析

[摘要] 根据丹参转录组数据提供的基因片段设计特异引物，采用RACE方法克隆类贝壳杉烯氧化酶（smkol）全长cDNA

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2.4 SmKOL基因的表达分析 取0.1 g毛状根样品采用Trizol试剂盒提取总RNA，用Takara反转录试剂盒反转录成cDNA。其过程为：总RNA模板1 μL（约200 ng），dNTP 1 μL， Radom 6 mers 2 μL，不含RNase的去离子水至10 μL，离心，置于PCR仪上，65 ℃ 5 min，之后冰上急冷。然后加入5×PrimerScript Buffer 4 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，PrimerScript Rtase 1 μL，RNase free H2O 4.5 μL。PCR反应条件为30 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min，所得cDNA用于Real-time PCR。根据丹参内参β-actin和目标基因SmKOL的核苷酸序列设计引物。其中β-actin上游引物为5′ -AGGAACCACCGATCCAGACA-3′，下游引物为5′ -GGTGCCCTGAGGTCCTGTT-3′；SmKOL上游引物为5′ -GCTTCTGGCAAGGCAATCAAC-3′，下游引物为5′ -CTTTTCCTCGTTGAGTTGGTCG-3′。转录后的cDNA用管家基因引物β-actin进行普通PCR反应，用于反转录质量控制，待目的基因引物及管家基因引物检测合格后，在ABI7300 RT-PCR仪上进行荧光定量检测，反应体系为：5 μL Power SYBR Green PCR Master Mix，0.2 μL引物F，0.2 μL引物R，1.0 μL cDNA，3.6 μL ddH2O。PCR反应条件为95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s；60 ℃ 34 s，40个扩增循环；检测溶解曲线。反应结束后分析荧光值变化曲线和溶解曲线。每个反应重复3次，采用2-ΔΔCT法分析结果。

3 结果

3.1 丹参毛状根SmKOL基因的全长克隆及序列分析 将基因cDNA序列进行Blast比对分析，结果表明测得的片段与其他植物中的KO基因有70%左右的同源性，并有相似的保守区域。将所得的片段进行拼接，获得基因全长序列，共1 884 bp核苷酸，命名为SmKOL，GenBank登录号为KJ606394，DNAMAN软件结合ORF Finder在线软件对SmKOL基因全长cDNA序列进行分析，推测编码519个氨基酸的蛋白质，并含有完整的开放阅读框（open reading frame， ORF），SmKOL基因的开放阅读框位于23～1 582 bp，序列的1～22 bp为5′非翻译区（5′UTR），1 583～1 884 bp为3′非翻译区（3′UTR）。

Blast结果显示SmKOL基因与甜橙Citrus sinensis的KO基因有68%相似， 西洋梨Pyrus communis的KO基因有66%相似、苜蓿Medicago truncatula的KO基因有67%相似、葡萄Vitis vinifera的KO基因有65%相似、拟南芥Arabidopsis thaliana的KO基因有64%相似、粳稻Oryza sativa Japonica Group的KOL基因有57%相似。KOL具有比较保守的结构域，用DNAMAN程序对比葡萄（AFD54196.1）、苜蓿（XP_003637273.1）、西洋梨（AEK01241.1）、粳稻（AAT81230.1）拟南芥（AED93499.1）的氨基酸序列进行多序列比对（图1）。结果表明家族具有较高同源性。使用Interpro结构域比对，结果表明SmKOL具有与IPR001128的Cytochrome P450 domain和IPR017972的Cytochrome P450相同保守位点（图2）。

3.2 KOL氨基酸序列的分子系统进化树分析 将SmKOL与GenBank中的17种植物的17种蛋白进行比对分析，在软件MEGA 5.1上采用相邻链接法构建KOL进化树，进行聚类分析（图3）。SmKOL与阿拉比卡种小果咖啡KOL聚为一类，两者在本文所选蛋白中的亲缘关系最近。

3.3 理化性质和3D结构预测 使用ExPASy在线服务器的Compute pI/Mw工具预测，SmKOL蛋白的相对分子质量为58.88 kDa，等电点pI 7.62。亚细胞定位结果表明可能定位于细胞质或者细胞核。信号肽分析表明为分泌蛋白，前23个氨基酸可能是信号肽，跨膜域分析可能为膜蛋白。SmKOL蛋白的二级结构预测结果显示，α螺旋结构占50.10%、β折叠结构占6.36%、无规则卷曲结构占43.55%。蛋白质的功能很大程度上取决于其空间结构，无规则卷曲结构决定了蛋白质，尤其是酶的功能部位常常位于这种构象区域，而α螺旋主要对蛋白质骨架起稳定作用，通过对蛋白质二级与三级结构预测和分析，有助于理解蛋白质功能与结构的关系[10]。使用Swiss Model进行同源建模，以人Cytochrome P450 2R1蛋白A链（PDB注册号3czh.1.A）作为同源模板，用于建模的氨基酸序列残基为46～511位，序列相似性为23.56%，模型质量得分（GMQE）0.55（图4）。

3.4 SmKOL受茉莉酸甲酯（MeJA）诱导的诱导表达分析 实时荧光定量PCR实验数据结果采用2-ΔΔCT法进行相对定量表达分析，即确定目标基因（SmKOL）和参照基因（β-actin）有相近的扩增效率，就可以确定不同样本中目标基因表达水平的相对差异。不同时段MeJA诱导的丹参毛状根中SmKOL相对表达发现，MeJA能明显诱导丹参毛状根中SmKOL基因mRNA的表达。实验检测了丹参毛状根经MeJA处理12，24，36，120 h后SmKOL基因的诱导表达情况，结果显示经MeJA处理后的SmKOL基因的诱导表达水平在0～36 h逐渐升高，在36 h时达到最大值，随后120 h时SmKOL基因的表达量下降（图5）。

4 讨论

由于丹参毛状根具有遗传稳定性高、产率高等优点，近年来常应用于次生代谢产物的生产。本研究首次从丹参毛状根中克隆得到了赤霉素代谢途径上的KOL基因，获得含有完整ORF的基因全长，并利用生物信息学的方法对其核酸及其推测的蛋白序列组成进行分析。结果表明，该基因与其他物种中的KO基因有较高的同源性，命名为SmKOL，它具有Cytochrome P450 domain，这在所有的家族成员中都是保守的。

同时，SmKOL基因诱导表达结果表明，经诱导子MeJA诱导后，SmKOL的mRNA表达量逐渐上调，在36 h达到最大值，之后表达量下降。随着丹参赤霉素生物合成途径中基因的不断挖掘，为在分子水平上认识赤霉素合成途径中的编码基因、调控方式、酶反应动力学及其代谢调节的分子机制奠定基础[11]。SmKOL基因的克隆为进一步研究该基因的功能和丹参赤霉素生物合成及其次生代谢调控机制提供了靶基因。

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Cloning and bioinformatics analysis of ent-kaurene oxidase

synthase gene in Salvia miltiorrhiza

HU Ya-ting1， GAO Wei2， LIU Yu-jia2， CHENG Qi-qing2， SU Ping2， LIU Yu-zhong1， CHEN Min1*

（1. State Key Laboratory of Dao-di Herbs， National Resource Center for

Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

2. School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100069， China）

[Abstract] Based on the transcriptome database of Salvia miltiorrhiza， specific primers were designed to clone a full-length cDNA of ent-kaurene oxidase synthase （SmKOL） using the RACE strategy. ORF Finder was used to find the open reading frame of SmKOL cDNA， and ClustalW has been performed to analysis the multiple amino acid sequence alignment. Phylogenetic tree has been constructed using MEGA 5.1. The transcription level of SmKOL from the hairy roots induced by elicitor methyl jasmonate （MeJA） was qualified by real-time quantitative PCR. The full length of SmKOL cDNA was of 1 884 bp nucleotides encoding 519 amino acids. The molecular weight of the SmKOL protein was about 58.88 kDa with isoelectric point （pI） of 7.62. Results of real-time quantitative PCR analyses indicated that the level of SmKOL mRNA expression in hairy roots was increased by elicitor oMeJA，and reached maximum in 36 h. The full-length cDNA of SmKOL was cloned from S. miltiorrhiza hairy root， which provides a target gene for further studies of its function， gibberellin biosynthesis and regulation of secondary metabolites.

[Key words] Salvia miltiorrhiza； ent-kaurene oxidase synthase； rapid-amplification of cDNA ends； bioinformatics analysis

doi：10.4268/cjcmm20142118