西双版纳地区热带雨林气候对免疫组化结果的影响

【摘要】 目的：分析西双版纳地区热带雨林气候对免疫组化结果的影响。方法：研究地点定在西双版纳地区，了解西双版纳地区的温度、海拔、大气压、水沸点。研究材料分别为鼻咽鳞状细胞癌、甲状腺状癌、胃神经内分泌癌、淋巴结反应性增生，按照规范的步骤进行操作。结果：修复时间20 min时（此时间为Dakota公司在其他地区用的传统时间），组织着色，阳性结果不显著，背景清晰；修复时间19 min时（比传统时间少1 min）组织已经着色，阳性结果不肯定，背景清晰；修复时间21 min时（比传统时间多1 min），组织着色，阳性结果显著，背景清晰，而且组织无脱落，修复时间22 min时（比传统时间多2 min），组织着色，阳性结果显著，背景清晰，但组织已部分脱落。结论：高温高压修复法是一种比较实用的抗原修复方法，特别是对于标本数不是特别多的基层医院。只是要根据本地区的海拔不同有所不同，要找到适合时间才能有好的效果。低海拔地区西双版纳州景洪市就只为21 min，可以推广运用。

【关键词】 西双版纳地区； 热带雨林气候； 免疫组化； 影响

doi：10.14033/ki.cfmr.2017.2.027 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2017）02-0053-02

病理诊断的金标准发展至今，其辅助手段也随之得到了良好的发展，如免疫组化就是最好的辅助手段，但免疫组化很娇嫩，对地域的要求因海拔的不同而有所改变，所以要根据不同的地域控制时间的长短，不断提高其质量，使它更好地为诊断服务[1]。免疫组织化学技术的原理是对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究的技术[2]。已有研究表明：修复液的温度和作用时间对修复效果有决定性的作用，温度越高修复时间越短，在昆明地区（海拔为1800 m左右）修复时间为30 min，但在低海拔地区西双版纳州景洪市就只为21 min[3]。

1 材料与方法

1.1 实验地气候

本实验在海拔550 m、大气压为94.29 kPa、水沸点97 ℃～98 ℃、西双版纳景洪市进行。西双版纳位于北纬21°10'～22°40'，东经99°55'～101°50'，最高海拔2429.7 m，最低海拔477 m，相对高差1952.7 m。是世界上北回归线附近保存最为完好、面积最大的热带雨林。景洪市属于低海拔（约500 m），年平均气温（18 ℃～21 ℃）高，湿润（年降雨1100～1900 mm）的地区，笔者率先在西双版纳州成功开展了第1例免疫组化，并通过笔者所在科2013年至今开展的200多例免疫组化结果对照，并与其他地区进行比较。

1.2 材料

10%中性甲醛固定，酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，组织分别为鼻咽鳞状细胞癌、甲状腺状癌、胃神经内分泌癌、淋巴结反应性增生。各蜡块分别切片5 μm，按照免疫组化步骤（Elivision法，试剂来源于Dakota公司）。

1.3 免疫组化操作过程

（1）石蜡涂片脱蜡和水化后，用PBS（PH714）冲洗3次，每次3 min。（2）根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。（3）每张涂片加50 μl 3%过氧化氢溶液，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3 min。（4）每张涂片根据需要加50 μl的第一抗体（如CD20、CD3、CD45RO、CD45RB、TdT，MPO、CD5、CD56、CD79a、CD43、CD5、CD10），室温下孵育60 min。（5）除去PBS液，每张涂片加50 μl聚合物（polymer enhancer），室温下孵育20 min，PBS冲洗3次，每次3 min。（6）除去PBS液，每张涂片加50 μl酶标抗鼠/兔聚合物（polymerized HRP-AntiMs/RbIgG），室温下孵育30 min PBS冲洗3次，每次3 min。（7）除去PBS液，每张涂片加50 μl新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3～10 min。（8）自来水冲洗，苏木紫复染，盐酸分化，自来水冲洗，PBS返蓝。（9）涂片经过梯度酒精脱水干燥，用DAE显色，中性树胶封固。

2 结果

修复时间20 min时（此时间为Dakota公司在其他地区用的传统时间），组织着色，阳性结果不显著，背景清晰；修复时间19 min时（比传统时间少1 min）组织已经着色，阳性结果不肯定，背景清晰；修复时间21 min时（比传统时间多1 min），组织着色，阳性结果显著，背景清晰，而且组织无脱落，修复时间22 min时（比传统时间多2 min），组织着色，阳性结果显著，背景清晰，但组织已部分脱落，具体见表1。镜下表现如下，

图1：胃神经内分泌癌SYN免疫组化染色，pH 9.0，1 mmol/L EDTA中煮沸30 min，胞浆强阳性染色，部分区域组织脱落（×200）。图2：

淋巴结反应性增生CD20免疫组化染色，pH 6.0，0.01 mmol/L在柠檬酸修复液中高压煮沸20 min，胞膜强阳性染色，背景清晰（×200），图3：鼻咽低分化鳞癌HCK免疫组化染色，pH 6.0，0.11 mmol/L柠檬酸修复液中煮沸20 min，胞浆强阳性染色，部分区域组织脱落（×200），图4：甲状腺状癌免疫组化染色，pH 6.0，0.01 mmol/L在柠檬酸修复液中高压煮沸20 min，胞膜强阳性染色，背景清晰（×200）。

3 讨论

众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性[4]。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色DAB显示为棕黄色颗粒）[5]。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量[6]。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测[7]。抗原的修复通常有物理修复及化学修复，目前的国内根据不同的抗体主要的修复方法有：高温高压.胰酶修复、胃蛋白酶修复、EDTA修复，免疫组化技术都要求在高温高压下进行的[8]。随着精准医疗的理念，免疫组化也走进了大大小小的医院，成为诊断的好朋友。目前市场上的试剂很多，选择适合自己的很重要，也要根据自己地区的实际情况探索最佳方法。

本验结果显示，高温高压修复法是一种比较实用的抗原修复方法，特别是对于标本数不是特别多的基层医院。只是要根据本地区的海拔不同有所不同，要找到适合时间才能有好的效果。在低海拔地区西双版纳州景洪市就只为21 min，可以推广运用。

参考文献

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[5]张世杰，郎振为，王欣欣，等.联合应用磷脂酰肌醇蛋白多糖-3（GPC-3）和细胞角蛋白-19（CK-19）免疫组化检测在肝细胞肝癌诊断和鉴别诊断中的价值[J].首都医科大学学报，2011，32（5）：653-657.

[6] Li-Fu Li，Zheng-Jie Wei，Hong Sun，et al.Abnormal β-catenin immunohistochemical expression as a prognostic factor in gastric cancer：A meta-analysis[J].World Journal of Gastroenterology，2014，20（34）：12313-12321.

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[8] Raymond A Isidro，Myrella L Cruz，Caroline B Appleyard，et al.Immunohistochemical expression of SP-NK-1R-EGFR pathway and VDR in colonic inflammation and neoplasia[J].World Journal of Gastroenterology，2015，21（6）：1749-1758.

（收稿日期：2016-09-07）