宫颈鳞状细胞癌组织中Bcl-2与血管内皮生长因子的表达及相关性

【摘要】 目的 探讨凋亡抑制基因Bcl-2与血管内皮生长因子(VEGF)蛋白在宫颈鳞状细胞癌中的表达,以及二者表达与宫颈鳞状细胞癌中生物学行为的相关性。方法 分别对45例宫颈鳞状细胞癌中组织、34例CIN组织和10例正常宫颈组织，采用免疫组织化学法检测Bcl-2的表达，免疫蛋白印迹(Western Blotting)法检测VEGF蛋白的表达，并采用DNA原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡指数(AI)。结果 Bcl-2和VEGF蛋白在45例宫颈鳞状细胞癌组织中的阳性表达率分别为51.11%和62.22%，均显著高于CIN组织(11.76%和5.88%)(P

【关键词】 肿瘤标志物；宫颈鳞状细胞癌；血管内皮生长因子

Expression of Bcl-2 and Its Correlation With Vascular Endothelial Growth Factor in Squamous Cell Carcinoma of the Cervical

CAO Wei, CAI Hong-bing.

Gynecology of oncology, Zhongnan Hospitol affiliated Wuhan University, Wuhan430071, China

【Abstract】 Objective To investigate the expression of significance of bcl-2 as a member of inhibitor apoptosis gene family and its correlation with vascular endothelial growth factor (VEGF) protein in the tissues of squamous cell carcinoma of the cervical. Methods Immunohistochemical techniques were used to detect the expression of bcl-2 and Western Blotting technique was used to detect the expression of VEGF protein in 45 cases of squamous cell carcinoma of the cervical tissues, 34 cases of CIN tissues and 10 cases of normal cervical tissues, respectively. The apoptosis index (AI) was detected by TUNEL method. Results The positive expressions of bcl-2 and VEGF protein in squamous cell carcinoma of the cervical tissues were respectively 51.11% and 62.22% which were significantly higher than CIN tissues(P

【Key words】

Bcl-2; Squamous cell carcinoma of the cervica; Vascular endothelial growth factor

宫颈癌是全球妇女恶性肿瘤中仅次于乳腺癌的第2个最常见恶性肿瘤。每年全世界新增病例大约500000例。在发展中国家妇女中发病率居第1位［1］。宫颈癌的发生和发展是细胞增殖分化异常和细胞凋亡异常共同作用的结果。已有研究证实，恶性肿瘤的发生、发展、浸润及转移的各个阶段都有赖于肿瘤新生血管的形成，而肿瘤血管的生成与细胞凋亡存在一定的关系，但其具体的调控机制尚不清楚［2,3］。血管内皮细胞生长因子(VEGF) 是目前所知的作用最强的促血管生成因子，对肿瘤血管的形成有重要作用。Bcl-2是目前研究最广泛、最深入的凋亡调控基因之一，在多种上皮肿瘤中都有异常表达，可作为多数恶性肿瘤独立的预后因子。本研究采用免疫组织化学方法观察Bcl-2 和VEGF在宫颈鳞状细胞癌组织的表达，以及二者表达的相关性，借以探讨Bcl-2、VEGF与宫颈鳞状细胞癌的生物学行为的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 采集我院2006年1月至2009年1月经病理证实的临床资料较完整的宫颈浸润癌标本45例，CIN 34例，以及另取10例子宫肌瘤患者手术切除并经病理证实的正常宫颈组织作为对照。所有标本均置-70℃保存备用。患者年龄22~78岁，平均(40.1±1 1.2)岁。

1.2临床分期、病理分型及病理分级 34例CIN中包括CIN I级8例，CINⅡ级11例，CINⅢ 级15例。45例宫颈浸润癌标本根据1970年再次修订的FLGO临床分期标准，分为Ⅰa期3例，Ⅰb期10例，Ⅱa期22例，Ⅱb期8例，Ⅲ 期2例；按组织病理学分级分为高分化19例，中分化8例，低分化18例；按照肿瘤生长类型分为外生型28例，内生型3例，溃疡型5例，颈管型9例。45例宫颈癌患者中39例行广泛性子宫切除术+盆腔淋巴结清扫术(包括Ⅰa 期3例、Ⅰb期9例、Ⅱa期20例、Ⅱb期7例)，有淋巴结转移者11例，无转移28例。所有标本均置-70℃保存备用。

1.3 检测方法

免疫组织化学检测Bcl-2蛋白：免疫组化操作步骤参照二步法EliVision(TM)试剂盒说明书进行。Bcl-2免疫组化阳性产物呈棕黄色细颗粒状，定位于胞浆。在同一光强度下，随机选取5个高倍视野(400)，通过HPIAS-1000型高清晰度彩色病理图文分析系统,计数每个高倍视野100个细胞，以阳性细胞数>10%视为Bcl-2蛋白表达阳性。

Western Blotting检测VEGF蛋白：取匀浆器处理后的标本，离心取上清，然后按试剂盒说明书进行操作，最后在暗室中进行化学发光法显影，设立不加一抗的阴性对照组，Western blotting 蛋白条带检测光密度值以测定VEGF蛋白的阳性表达率。

TUNEL法检测细胞凋亡： 检测程序参照试剂盒说明书进行，以PBS代替TdT混合缓冲液作为阴性对照。TUNEL阳性染色物质呈棕褐色颗粒状，定位于胞核。随机选取10个高倍视野，通过HPIAS-1000分析系统,计数1000个细胞中TUNEL阳性细胞总数，以平均100个细胞中含有凋亡细胞所占的百分比，即为凋亡指数(AI)。

1.4 统计学分析

采用统计软件包SPSS 11.5进行分析，选择性采用χ2检验、Fishs精确概率法，P

2 结果

2.1 Bcl-2和VEGF蛋白在三种组织的表达

Bcl-2和VEGF蛋白在宫颈鳞状细胞癌组织中和在CIN的阳性表达率见表1。表1 显示，宫颈鳞状细胞癌组织中Bcl-2和VEGF蛋白的表达率均显著高于正常宫颈组织和CIN组织(P

2.2 Bcl-2表达与宫颈鳞状细胞癌生物学行为特征的关系

Bcl-2的阳性表达与宫颈鳞状细胞癌的淋巴转移相关，和肿瘤的组织病理学分级、临床分期有一定关系；而与患者的年龄、肿瘤直径、肿块生长类型无相关性，见表2。

2. 3 Bcl-2的表达与AI的关系

宫颈鳞状细胞癌组织中Bcl-2表达阳性的AI明显低于阴性表达的AI，见表3。

2.4 宫颈鳞状细胞癌组织中Bcl-2和VEGF表达的相关性分析

在VEGF 阳性表达的宫颈鳞状细胞癌组织中Bcl-2阳性表达率为64.29%，VEGF阴性表达中的Bcl-2阳性表达率为29.41%，χ2检验分析表明，VEGF 阳性表达的宫颈鳞状细胞癌组织中Bcl-2高度表达(χ2=5.148，P

3 讨论

Bcl-2是一种原癌基因,具有阻断程序化细胞死亡的作用。它通过抑制细胞的程序死亡, 破坏细胞数量的动态平衡, 导致肿瘤的发生， 目前已发现, Bcl-2 蛋白在多种上皮性肿瘤中均异常表达如胃癌和前列腺癌，但对细胞凋亡调控的分子机制尚不十分清楚［4］；可能与其表达产物阻断内源性核酸内切酶的DNA切割活性,从而阻断细胞凋亡有关。

Bcl-2的抗凋亡作用是促进肿瘤细胞存活的主要机制之一,且其表达往往与肿瘤的发展及预后密切相关。本研究结果显示，45例宫颈鳞状细胞癌组织中，32例有Bcl-2的表达(51.11%)，34例CIN仅有4例有表达(11.76%)，而在正常宫颈组织无表达，Bcl-2在正常组织、CIN及宫颈癌中逐渐增高的表达进一步说明Bcl-2可能参与宫颈鳞状细胞癌的发生和发展。Bcl-2表达阳性组AI指数明显低于Bcl-2表达阴性组AI指数，提示Bcl-2在宫颈鳞状细胞癌中的高度表达与其抑制肿瘤细胞凋亡的作用是分不开的。国内在研究Bcl-2与宫颈癌预后关系中，齐荣义［5］等发现Bcl-2表达与宫颈鳞癌的病理分级有关，分化程度较好的宫颈鳞癌中Bcl-2表达率较高。并提示Bcl-2基因的变化在宫颈癌发生和发展中起重要作用，其过度表达提示较好的临床行为和预后。本研究表明，宫颈鳞状细胞癌组织中Bcl-2表达与病理分级和临床分期有关，这与部分学者的研究结果是一致的。因而针对Bcl-2的抑制和促进将会成为很好的肿瘤基因治疗及药物治疗的靶点而为临床治疗提供新思路，Tjalma等［6］的研究结果提示，Bcl-2是宫颈癌的凋亡路径中最重要的蛋白之一，它可能成为凋亡与肿瘤治疗的新靶点。

肿瘤血管形成是肿瘤细胞生长、侵袭和转移的必要条件之一。 VEGF具有重要的血管形成作用，是重要的促血管形成因子。同时，VEGF也是重要的血管渗透因子，VEGF能增加后毛细血管和小静脉等微小血管对大分子的通透性，引起血浆蛋白渗出到血管间隙,外漏的纤维蛋白原凝固成纤维蛋白而沉积,纤维蛋白可作为临时性基质支持新生血管的生长［7］。本研究结果显示，正常宫颈组织中无VEGF表达，而宫颈癌组织显著增加，与报道相似［8］。Boocock等［9］认为，VEGF不仅促进血管生成，还可通过旁分泌或自分泌作用刺激肿瘤细胞生长，在肿瘤细胞中过度表达，提示VEGF可能成为判断恶性程度及预测预后的指标。本研究发现，VEGF在宫颈鳞状细胞癌中的阳性表达率为62.22％，CIN组织的表达仅为5.88％，正常组织中未见阳性表达，说明VEGF在宫颈鳞状细胞癌中高表达，其表达与宫颈鳞状细胞癌组织中血管生成密切相关。

已有研究证实，VEGF可诱导和促进血管内皮细胞中Bcl-2的高表达，同时，Bcl-2 又可以抑制了由NO诱导的血管内皮细胞的凋亡,促进了血管的形成［10］。Pidgeon 等［11］发现VEGF诱导了癌细胞中Bcl-2的高表达,而抗VEGF 抗体可抑制Bcl-2 的高表达,促进了肿瘤细胞的凋亡。本研究显示，28例宫颈鳞状细胞癌组织VEGF阳性表达中有18例Bcl-2表达阳性(64.29%)，17例VEGF阴性表达中有5例 Bcl-2 表达阳性(29.41%)，提示Bcl-2的高表达与VEGF蛋白的表达密切相关, 推测Bcl-2可能通过上调VEGF的表达和增强肿瘤组织微血管的形成，从而促进宫颈鳞状细胞癌的转移,VEGF也通过促进Bcl-2的表达抑制肿瘤细胞凋亡，但其具体作用机制尚不清楚,有待进一步研究。

参 考 文 献

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［4］ Hockenbery D M, Zutter M, Hickey W, et al. Bcl-2 Protein is topographically restricted in tissue characterized apoptotic cell death. Proc Natl Acad Sci USA, 2001：3619.

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［11］ Pidgeon G P，Barr M P，Harmey J H，et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF) upregulates bcl-2 and inhibits apoptosis in human and murine mammary adenocarcinoma cells. British Journal of Cancer,2001：273-278.

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