温固化水凝胶负载骨髓基质干细胞修复兔关节骨软骨缺损的实验研究

[摘要]目的：探讨温固化水凝胶作为骨髓基质干细胞的载体修复软骨缺损的可行性。方法:将培养的骨髓基质干细胞与400g/L浓度的温化水凝胶混合后移植到兔膝关节软骨缺损中，分别于术后4、8、12周观察大体标本及组织学修复结果。结果：实验组的缺损为透明软骨修复。而单纯材料组和空白对照组则以纤维组织修复。参考Wakitani制定的组织学评分标准，Pluronic F-127组和空白对照组的组织学评分在各个时期无显著的差异（P＞0.05）,而实验组和空白组在各个时期均存在显著的差异（P＜0.05）。结论：Pluronic F-127可作为软骨组织工程良好的支架材料。

[关键词]温固化水凝胶；骨髓基质干细胞；组织工程；软骨缺损

[中图分类号]R318.5R684[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）03-04

The experimental study on bone marrow stromal cells loaded temperature dependent hydrogel on repair of full-thickness defects of rabbit articular cartilage

WANG Jin-ming,ZHANG Qing-guo,ZHAGN Jiao

（School of Clinical Medical College Southeast University， Nanjing 210009，Jiangsu，China）

Abstract:ObjectiveTo investigate the feasibility of the temperature dependent hydrogel loading bone marrow stromal cells for repairing articular cartilage defects. Methods Cultured bone marrow stromal cells and 4OOg/Lhydrogelmixture was transplanted to the knee articular cartilage defects in rabbits, after 4, 8 and 12 weeks, Repair of articular cartilage defect was investigated by gross observation and HE stain of histological specimens.Results In the experimental group the defect was repaired by hyaline cartilage. While in the Pluronic F-127 group and control group the defect was repaired by fibrous tissue. Referencing Wakitani developed histological grading scale . Between the Pluronic F-127 group and the control group in the histologic score in each period there was no significant difference (P> 0.05), while between the experimental group and control group in each period there was significant difference (P

Key words: temperature dependent hydrogel; BMSCs; tissue engineering; articular cartilage defect

关节软骨的自我修复能力很弱，是矫形外科一个非常棘手的问题[1]。很多的方法如关节软骨下骨钻孔, 骨膜或软骨膜修补等方法均有待临床进一步应用验证［2］。组织工程学的方法对膝关节软骨损伤有重要的应用前景。骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs) 含有形成前体细胞及干细胞, 可体外培养并诱导向软骨细胞方向分化。而一定浓度的聚氧化乙烯－聚氧化丙烯－聚氧化乙烯(PEO－PPO－PEO)三嵌段共聚物（Pluronic F-127）水溶液具有在低温下为液态而常温下为固态的特性，即温固化水凝胶［3］。本实验中以BMSCs为种子细胞，可注射性生物材料Pluronic F-127为支架，在低温下将此混合物注射到兔膝关节全层软骨缺损处，观察其修复作用。

1材料和方法

1.1材料：DMEM干粉(低糖型)(GIBCO公司)，胰蛋白酶 （SIGMA公司），Percoll细胞分离液（SIGMA公司），Pluronic F-127（SIGMA公司）,50ml培养瓶（丹麦NUNC公司），SW-CJ-IF超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），OLYMPUSCK2光学倒置显微镜（日本OLYMPUS公司），GB-B16 CO2细胞培养箱 （美国Heraeus公司）

1.2 方法

1.2.1 温固化水凝胶的制备：将Pluronic F-127 以1g分装在青霉素安瓿瓶中密封好，CO60照射灭菌。于超净台中在每小瓶材料中加入2.5mlPBS。密封后置于4℃冰箱。

1.2.2 BMSCs的获取和培养：成年灰兔，体重2.0～2.5kg,分别在全麻、无菌下暴露双侧髂骨, 16号骨穿针抽取双侧髂骨骨髓总量约4.0ml,加入等量PBS稀释，混匀，以1∶4比例加入淋巴细胞分离液，2 000r/min离心30min，取中间白色云雾状细胞层，PBS液洗涤，加入含胎牛血清的DMEM标准培养液，以1×105/ml细胞密度接种于50ml培养瓶，37℃下5%CO2、100%湿度孵箱孵育，3天后首次换液，其后根据细胞生长情况及培养液颜色确定换液时间。待细胞长满瓶底70％～80%时传代，逐日使用倒置显微镜观察细胞生长及形态特征。当原代细胞培养7～9天时细胞融合为单层，占瓶底80%以上，0.25%胰蛋白酶消化传代，培养至第三代备用。

1.2.3 BMSCs与Pluronic F-127复合物的制备：取生长良好的第三代BMSCs四瓶消化，1500r/min离心5 min，得细胞沉淀，以1ml 培养液重悬细胞, 进行细胞计数。细胞数约为1×107[4]。在5ml离心管中加入Pluronic F-127溶液 0.5ml,细胞悬液0.5ml。密封于离心管，置于4℃冰箱。

1.2.4 动物实验：健康灰兔27只，体重2.5～3.5kg ,雌雄不限,编号后随机分成A、B、C三组，每组九只，双膝均用于实验。用3 %戊巴比妥钠(1mg/kg) 静脉麻醉,仰卧位固定,剪毛、常规消毒铺巾,取髌骨内侧切口,依次切开各层,髌骨向外侧脱位, 屈曲膝关节, 充分暴露股骨关节软骨面, 用直径4mm钻头于股骨关节面中心造成深度约3mm的全厚关节软骨缺损。A组：（18膝）缺损处注入细胞、材料及生长因子三者的复合物。B组：（18膝）缺损处单纯注入400g/L Pluronic F-127凝胶。C组：（18膝）缺损处不做任何处理，为空白对照。髌骨复位,逐层缝合。同条件分笼饲养,自由活动。

1.2.5 结果检测：分别于术后4、8、12周空气栓塞处死动物，取材，行大体及组织学观察：①大体观察：膝关节活动情况，关节滑膜有无充血水肿，关节囊有无增厚粘连及关节面缺损修复的平整度及光泽度；②组织学检测：取材后10%福尔马林固定48h,5%硝酸脱钙液脱钙24h,冲洗、系列酒精脱水、石蜡包埋、5μm切片、HE 染色光镜观察

1.2.6 统计学分析：参考Wakitani制定的组织学评分标准［5］（表1），所有实验结果计量资料以x±s表示,采用SPSS11.5软件进行统计分析，α值取0.05。

2结果

2.1 功能评价：术后3天内，兔膝关节活动受限，活动较少。随后运动逐渐增加，屈曲姿态和跳跃动作逐渐正常，1周内恢复正常。

2.2 大体形态观察：膝关节无红肿，关节囊无明显增生肥厚，无挛缩、粘连；关节液清亮。

2.2.1 A组：术后4周，填充物与周围正常软骨分界清楚，大部分呈淡红色半透明，缺损填充物周边部见部分呈乳白色；填充物表面平整光滑，与周围正常软骨连接良好，高度基本一样或略微凹陷；触之微韧，与周围正常软骨能分离。术后8周，填充物与周围软骨分界不明显，呈乳白色，与正常软骨颜色接近，表面光滑，与周围软骨连接好，高度与周围软骨基本一致；触之质韧，与周围正常软骨不能分离。术后12周，填充物与周围正常软骨分界模糊，呈乳白色，填充物表面平整光滑，与周围软骨连接好，高度与周围软骨基本一致；触之质韧，与周围正常软骨基本一致，与周围正常软骨不能分离（图1）。

2.2.2 B组：术后4周，填充物与周围正常软骨分界清楚，大部分呈半透明状，周边部见部分呈白色，填充物表面平整光滑，与周围正常软骨连接良好，高度基本一样或略微凹陷；触之微韧，与周围正常软骨能分离。术后8周，填充物与周围软骨分界不明显，呈白色，表面略粗糙，与周围软骨连接好，高度略微低于周围正常软骨；触之质韧，与周围正常软骨不能分离。术后12周，填充物与周围正常软骨分界不清楚，呈白色，填充物表面凹陷不平，与周围软骨连接好，高度略低于周围正常软骨；触之质硬，与周围正常软骨不能分离(图2)。

2.2.3 C组：术后4周，缺损区由白色组织填充，可见血凝块甚者部分缺损区骨质无组织覆盖，表面粗糙，与周围正常软骨连接不佳，高度低于周围正常软骨；触之软，与周围正常软骨能分离。术后8周，缺损区由白色组织填充，周边可见部分骨质无组织覆盖，表面粗糙不平，高度低于周围软骨，触之质韧，与周围正常软骨不能分离。术后12周，缺损区由白色组织填充，周边可见部分骨质无组织覆盖，表面粗糙不平，高度低于周围软骨，触之硬，与周围正常软骨不能分离（图3）。

2.3组织学观察

2.3.1 A组：术后4周，缺损填充区可见增殖的软骨细胞，细胞排列不规则，成簇生长，细胞形态较少，基质较少，表面可见部分纤维样组织，可见不连续的软骨下骨(图4)。术后8周，缺损填充区可见软骨细胞增多，基质较多，细胞周围可见典型的陷窝样结构，软骨下骨连续性好(图5)。术后12周，缺损填充区形态与周围正常软骨相似，细胞形态、排列，基质量接近周围正常软骨(图6)。

2.3.2 B组：术后4周，缺损填充区主要被纤维样组织覆盖，可散在见软骨细胞，软骨下骨生成较少。术后8，12周，缺损填充区同样主要为纤维样组织覆盖，软骨下骨逐渐增厚与正常接近(图7)。

2.3.3 C组：修复各个时期，缺损区均为纤维组织覆盖，无软骨细胞。软骨下骨逐渐增厚(图8)。

2.4统计分析结果：A、B、C三组在4、8、12周时所采集的数据，以x±s表示（表2）,采用SPSS11.5软件进行统计分析，对数据显著性检验采用两样本均数比较的t检验。P＜0.05为差异显著。实验组（A组）和空白对照组相比在各个时期均有显著性差异(P＜0.05 ),单纯材料组（B组）和空白对照组相比在各个时期无显著性差异（P＞0.05）。

3讨论

成熟的关节软骨损伤后其自我修复的能力十分有限，一般认为直径小于3mm的缺损可得到部分或全部的修复，而直径大于4mm的缺损一般不能以透明软骨形式修复[6]。本实验设计了约直径4mm、深3mm的关节软骨缺损模型。

软骨细胞培养扩增修复软骨缺损多有报道,但细胞获取及扩增均较困难[7],且软骨细胞修复软骨下骨效果不佳。BMSCs 能够根据微环境信号的指令分别分化为成骨细胞和软骨细胞, 适合于伴有软骨下骨损伤的软骨缺损修复。由于关节腔内的乏氧环境和关节液中各种细胞因子的作用, 促使骨髓BMSCs 向软骨细胞分化形成软骨组织。而缺损底部邻近髓腔, 较高的氧分压促使骨髓BMSCs 向成骨细胞转化形成骨小梁。软骨和骨小梁的形成有利于修复组织与邻近正常组织的结合。这样, 软骨层及软骨下层的骨缺损都能修复而形成正常的关节结构[8]。

本实验所应用的聚氧化乙烯－聚氧化丙烯－聚氧化乙烯(PEO－PPO－PEO) 三嵌段共聚物具有良好的生物相容性和良好的生物降解性［9-10］。它最大的特点是浓度大于100g/L的水溶液都有一个凝胶化温度, 当温度低于凝胶化温度时, 粘度很低,为粘性流体, 温度超过凝胶化温度时, 粘度急剧增高, 变为凝胶。400g/L时凝胶化温度约为4℃。因此我们可在低温下将此材料和细胞混合后注射至缺损区，操作上有了极大的便利。本实验结果示聚氧化乙烯－聚氧化丙烯－聚氧化乙烯(PEO－PPO－PEO) 三嵌段共聚物与骨髓基质干细胞（BMSCs）复合物能以透明软骨方式修复关节软骨缺损，而单纯材料组和空白对照组则以纤维样组织修复缺损，不能以透明软骨方式修复。

因此温固化水凝胶聚氧化乙烯－聚氧化丙烯－聚氧化乙烯(PEO－PPO－PEO) 在软骨组织工程中将有良好的应用前景。

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[收稿日期]2007-12-15[修回日期]2008-03-10

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