小儿毛细血管瘤的非线性光谱成像研究

[摘要]目的：探讨非线性光谱成像方法在临床上用于无损探测、实时监测小儿毛细血管瘤的病理生理过程，追踪其病程发展过程，以及评估治疗效果的潜力。方法：选取58例资料完整的小儿皮肤毛细血管瘤（颌面部）手术切除标本，其中增生期（2～12个月）26例，消退期（2～5岁）16例,消退完成期（6～11岁）16例。将样品切成30μm厚度，进行非线性光谱成像分析, 相应的正常皮肤做为对照。结果：正常皮肤与不同时期毛细血管瘤组织中的胶原蛋白和弹性蛋白纤维的含量、形态结构和光谱特性存在明显差异。结论：基于双光子激发荧光(Two-Photon Excited Fluorescence，TPEF)和二次谐波产生（Second Harmonic Generation，SHG)相结合的非线性光谱成像技术有可能成为临床上用于无损探测、实时监测小儿毛细血管瘤的病理生理过程，追踪其病程发展过程，以及评估治疗效果的有力工具。

[关键词]非线性光谱成像；毛细血管瘤；正常皮肤；胶原蛋白；弹性纤维

[中图分类号]R732.2[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）07-1093-05

Nonlinear spectral imaging for capillary hemangioma among children

XIONG Shu-yuan,ZHUANG Jing,YANG Jin-gu

(Department of Plastic Surgery,The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou,350005,Fujian,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the potential of nonlinear spectral imaging method for Non-destructive detection and monitoring of the pathophysiology of capillary hemangioma among children and for tracking the process of development of them as well as for assessment treatment responses in clinic.MethodsSelected 58 cases with complete data in skin capillary hemangioma of children ,which 26 cases (2～12 months) in proliferative phase, 16 cases (2～5 years) in resolution phase, 16 cases (6～11 years) in complete regression period .All of the tissue section samples of 30 lm thickness were analyzed by the use of a nonlinear spectral imaging system, normal skin in the control group. ResultsThere are significant differences between different phase of capillary hemangioma tissue and normal skin in terms of their morphological structure and the spectral characteristics of collagen and elastic fibers. ConclusionsNonlinear spectral imaging based on TPEF / SHG may be used for non-destructive detection and real-time monitoring in the pathophysiological process of capillary hemangioma, tracking the course of the development process, as well as a powerful tool for evaluating treatment effects.

Key words:nonlinear spectral imaging；capillary hemangioma ；normal skin；collagen；elastic fibers

毛细血管瘤是小儿最常见的良性肿瘤之一，虽然部分血管瘤可自行消退,但某些位于重要部位及难治性的血管瘤在其消退前常严重影响相应器官的功能，甚至危及生命。因此需积极进行干预和治疗。目前临床上治疗毛细血管瘤的方法很多，但治疗效果并不令人满意，随着对毛细血管瘤研究的不断深入，人们一直在努力寻找治疗血管瘤的最佳办法以及干预措施，而传统对病变过程及治疗效果的监测都是依靠临床经验，因此基于双光子激发荧光和二次谐波信号的非线性光谱分辨成像这种非侵入式活体定量检测技术研究血管瘤的病理生理改变、追踪增值退化演变过程，并能够对血管瘤的治疗过程进行实时监测以及对疗效进行客观地分析和评估，是十分必要且非常有意义的。

1材料和方法

1.1 按照Takahashi分类法[1]以及HE 染色后根据组织结构进行病理分期：胞质内管瘤组织20%以上部位有纤维变性或血管腔闭塞者为消退期，无上述组织结构改变者为增生期血管瘤。选取58例资料完整的小儿皮肤毛细血管瘤（颌面部）手术切除标本，其中增生期（2～12个月）26例，消退期（2～5岁）16例,消退完成期（6～11岁）16例。取相应的正常皮肤做为对照。标本来自于福建医科大学附属第一医院整形小儿外科。标本切下后，立即存放于-196℃液氮罐里直至使用。将样品切成30μm厚度，并把每片切片夹于载玻片于盖玻片之间。所有组织切片样本均进行非线性光谱成像分析。在整个成像过程中，为了避免样品的脱水和收缩，将PBS溶液（pH 7.4）喷洒于样品表面。

1.2 实验原理装置及图像、光谱分析：非线性光谱成像系统由一架倒置显微镜(Axiovert200，Zeiss LSM 510META)和一架美国相千公司生产的锁模钛宝石飞秒激光器(110fs，76MHz，波长范围700～98Onm)组装在一起；扫描显微系统:主要是由xY扫描器和步进马达(HRZ200，Zeiss)组成。所有图像为512×512像素，并有12位像素深度。本实验使用两种不同的渠道获取正常皮肤和不同时期毛细血管瘤组织中胶原蛋白和弹性蛋白的高对比度图像，一个通道对应于414～436 nm波长范围内，以显示组织中胶原蛋白倍频信号，而另一种通道对应于457～714nm波长范围内，在激发波长为850nm时显示弹力纤维。利用以成像为导向的光谱分析方法，通过绘制不同感兴趣区域内所有像素的平均强度与每个发射波段的中心波长来获得光谱，并记录和分析光谱。

1.3 统计分析：实验数据的计量资料以x±s表示，采用成组t检验及LSD-t检验。采用SPSS16.0统计软件分析。

2结果与分析

2.1 不同时期毛细血管瘤组织与正常皮肤中胶原蛋白和弹性纤维的高对比度成像及3D图像：图1、2在正常皮肤和不同时期毛细血管瘤组织中，胶原蛋白和弹性纤维的含量及形态结构有很大的差异。毛细血管瘤血管周围基质中胶原蛋白含量多，密度大，弹性纤维形态不完整、断裂，分布不均、排列极度紊乱（图1a、图2ABC），随着病程发展，消退期毛细血管瘤组织（图1b、图2DEF）周围胶原蛋白含量较增生期有所减少，密度也明显变小，病程进展至消退完成期时，病变组织周围基质中胶原蛋白含量较前更为减少，弹性纤维形态趋近完整，极少出现断裂现象，分布及排列已具有一定的方向和规律（图1C、图2GHI），正常皮肤样品中弹性纤维呈现为外形完整，排列有序，分布均匀一致（图1D、图2JKL）。激发波长为850nm下，在414～436nm波长范围内，二次谐波产生（SHG）提取到胶原蛋白图像（绿色编码），457nm到714nm波长范围内，双光子激发荧光（TPEF）成像提取到弹力纤维图像（红色代码）。

2.2 不同时期毛细血管瘤组织与正常皮肤中胶原蛋白的光谱信息：图3基于TPEF和SHG相结合的非线性光谱成像的最大优势是同时获取染色标本的图像和光谱，这一特点能提供组织更准确，更全面的生理和病理信息。图3显示了图1中所对应的不同时期毛细血管瘤组织与正常皮肤组织中胶原蛋白的发射光谱图像，而发射光谱的强度是评价其含量的重要指标：增生期、消退期、消退完成期毛细血管瘤组织中胶原蛋白SHG信号强度分别约为正常皮肤的1.6倍（图3A）、1.3倍（图3B）、 1.1倍（图3C），相对应的，增生期、消退期、消退完成期毛细血管瘤组织中胶原蛋白SHG含量分别约为正常皮肤的1.6倍、1.3倍、1.1倍。

2.3 不同时期毛细血管瘤组织与正常皮肤组织的光学信息：图4使用胶原蛋白SHG信号的深度依赖衰减常数可定量评估不同时期毛细血管瘤组织与正常皮肤组织中胶原蛋白分布排列特点。图4显示了不同时期小儿正常皮肤与毛细血管瘤组织中胶原蛋白的深度依赖衰减常数。正常皮肤中胶原蛋白深度依赖衰减常数（0.039±0.008）明显小于增生期毛细血管瘤组织的值（0.062±0.005）(0.001

2.4 不同时期毛细血管瘤组织与正常皮肤中弹性纤维的直径：通过对弹性纤维直径的测量，可进一步揭示弹性纤维形态结构。所有毛细血管瘤组织样本于真皮层每隔10μm深度进行切片，每层随机选择5条弹性纤维，测量其直径。并与正常皮肤（对照组）相比较。定量分析结果表明，增生期、消退期毛细血管瘤组织中弹性纤维直径均明显小于相应正常皮肤真皮层中弹性纤维直径。随着病程发展，增生期（1.67±0.20）μm 正常皮肤（2.32±0.25）（0.001

3讨论

3.1 毛细血管瘤小儿最为常见的一种良性肿瘤，在新生儿中发病率可高达10%[2]，可生长在身体的任何部位，其经历增殖期、消退期及消退完成期 3个阶段[3]。在这漫长而未知的过程中，患儿的身心健康可能会受到极大危害，对其家属造也造成了痛苦,这给医务工作者带来了挑战。虽然部分血管瘤可自行消退,并且这部分血管瘤很少危及生命或影响功能,但其消退前可导致不同程度的外貌缺陷，而难治性血管瘤,常生长在要害部位，如关节、颜面、、手指 (足趾)、,甚至颅脑、胸腹腔内和肌肉间等处 ,因其生长迅速、面积巨大而不能消退以致影响相应功能,甚至危及生命。

3.2 临床上，根据毛细血管瘤病变所属阶段的不同，治疗手段纷繁复杂，效果及预后差别悬殊。如果治疗不当，将会给患儿带来不必要的痛苦和损伤，给患儿家庭增加不必要经济负担，又浪费大量医疗资源，甚至部分患儿不但治疗无效，还可能在治疗过程中产生更大损害。因此，选择有效的方法对其进行治疗和干预，是非常有必要的，而如何制定最佳治疗方案，也是医务工作者必须面对的一个棘手的问题。目前临床上治疗婴幼儿毛细血管瘤的方法很多，但是治疗效果并不令人满意，最重要的原因是对其确切的病理生理及病变机制缺乏了解。非线性光谱成像技术可作为临床上对毛细血管瘤病变组织进行直接、实时、客观、无损地探测和监测的一种先进、有效的技术手段。

3.3 基于TPEF/SHG相结合的非线性光谱分辨成像技术是近年来发展起来的一种重要的非侵入式的光谱成像分析技术 [4-5]，具有自发性的光层析、较低的光漂白与光损伤、较佳的成像分辨率及对比度、较深的成像深度等优异的特性[6]，利用飞秒激光光源作用下，生物组织内在成分的谐波产生和双光子激发荧光的非线性光学效应，对组织内在成分进行成像及光谱分析[7-10]，并可用于活体成像，特别是活细胞，还可以使有效的观察时间更长。

3.4 人体组织内含有很多能发射荧光的物质，如弹力蛋白、色氨酸、黄素蛋白、NADH、胶原、血管、叶琳及其衍生物等，在恰当的激发光照射下无需外加分子探就能发射特定波长的荧光信号从而成像[11]。同一组织的不同部位，其成分与结构基相同，所以直接用适当波长的激发光照射时，其荧光光谱特征也应相同或相近。当该组织发生病变时，因为存在成分、结构及代谢状况上的变异，其荧光光谱特应与正常组织存在差异。同时，在肿瘤的整个病程发展过程中，除了组织形态不断发生相应的变化，正常和肿瘤组织的发射光谱也存在明显的差别。因此，此种方法对区分病变组织与正常组织具有较高的特异性，并能反映组织的固有信息，从而为深入研究肿瘤病变组织的内部分结构，探寻新的治疗药物和治疗方法提供理论依据和实验数据。该方法不需服用光敏剂，直接反映组织的内部结构信息，所以对组织创伤，无毒副作用，具有更大的优越性，在肿瘤的诊断和定位方面具有非常大的实用价值。

3.5 在毛细血管瘤最主要的病理学特征为血管异常增生、内皮细胞增殖活跃。而其病变发展过程也是血管内皮细胞的异常增殖与消退的过程。增殖期血管瘤镜下表现为大量毛细血管及微静脉构成的血管丛，内皮细胞增生活跃，形成团块状，内皮下有多层基膜形成，随着病程进展至消退期时，毛细血管及内皮细胞成分明显减少,直至消退完成期，血管及内皮细胞数量也逐渐恢复正常。这说明位于血管内皮细胞周围基质与增生的内皮细胞间存在明显相关性。而胶原蛋白是构成病变血管内皮细胞细胞外基质的主要结构蛋白，可通过与内皮细胞的相互作用而影响内皮细胞的行为，因此，胶原蛋白含量、分布与组织细胞的众多生理、病理活动密切相关，本实验结果显示，在血管瘤病理演变的过程中，增生期血管瘤组织中胶原表达明显高于消退期, 消退期血管瘤组织中胶原蛋白表达又高于消退完成期，三者间有显著差异性(P

3.6 根据不同时期毛细血管瘤组织和正常皮肤中，弹性纤维的微观形态、排列、分布及其结构所呈现出的巨大不同可以推断：在毛细血管瘤组织中弹性纤维体积减少可能是由于病变导致皮肤真皮层弹性纤维网变性、损伤，并且大量增生的胶原纤维，分割弹性纤维，直到病程发展到消退完成期，病变组织逐渐纤维化并自行愈合。

3.7 另一方面，不同时期毛细血管瘤组织与正常皮肤组织中胶原蛋白的发射光谱特征提供了更为精确的信息，这也说明了在血管形成及血管瘤的病理演变过程中，胶原蛋白和弹力蛋白作为构成细胞外基质的主要结构蛋白，起着关键作用，与病变发展密切相关。在毛细血管瘤的病程发展过程中（增生期-消退期-消退完成期），组织中胶原蛋白的含量也随之发生动态改变：逐渐减少，直至正常。这一结果也证实了胶原蛋白与愈合、组织纤维化有一定的关系，其含量可预示血管瘤的退化。

3.8 将正常皮肤和增生期毛细血管瘤组织中胶原蛋白和弹性蛋白纤维光谱测量与显微图像结合起来，对弹性纤维直径和细微结构进行分析，可以更加准确地获得毛细血管瘤病变组织的生理和病理信息。并且，应用这种无损的检测方法实时监控疾病的演变过程，在治疗过程中通过及时检测评估治疗效果，更好了解治疗机理并正确选择治疗方案，可以更为有效的评估治疗效果，为小儿毛细血管瘤的临床诊断与治疗提供客观、准确的依据。可能实现对婴幼儿毛细血管瘤形成、发展及其消退机制的更加深入的研究，达到阻止血管瘤发生或促进血管瘤消退的目的。

[参考文献]

[1]Takahashi K,Mulliken JB,Kozakewich HPW,et al.Cellular markers that distinguish the phase of hemangioma during infancy and childhood[J].J Clin lnvest,1994,93:2357-2364.

[2]GarzonM.Hemangiomas:Update on classification,clinical presentation,and associated anomalies[J]. Cutis,2000,66:5325-328.

[3]Mulliken JB,Glowacki J.Hemangiomas and vascular malformations ininfant and children:A classification based on endothelial characteristics[J].Plast ReconstrSurg,1982,69(3):412-422.

[4]Zipfel WR,Williams RM,Webb WW.Nonlinear magic:multi-photon microscopy in the biosciences[J].Nat Biotechnol,2003:21:1369-1377.

[5]So PTC,Chen YD,Barry RM.Two-photon excitation fluorescence microscopy[J].Annu Rev Biomed Eng,2000,2:399-429.

[6]Denk W,Strickler JH,Webb WW.Two-photon laser scanning fluorescence microscopy[J]. Science,1990,248:73-76.

[7]Kim BM,Eichler J,Reiser KM,et al. Collagen structure and nonlinear susceptibility: effects of heat, glycation, and enzymatic cleavage on second harmonic signal intensity[J].Lasers Surg Med,2000,27:329-335.

[8]Boulesteix T,Pena AM,Pages N,et al. Micrometer scale ex vivo multiphoton imaging of unstained arterial wall structur[J].International Society for Analytical Cytology,Cytometry Part,2005,69A:20-26.

[9]Pena AM,Strupler M,Boulesteix T,et al. Spectroscopic analysis of keratin endogenous signal for skin multiphoton microscopy[J].Opt Express,2005,13:6268-6274.

[10]White WM,Rajadhyaksha M,Gonzalez S,et al. Noninvasive imaging of human oral mucosa in vivo by confocal reflectance microscopy[J].Laryngoscope,1999,109:1709-1717.

[11]Campagnola PJ,Loew LM.Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecul ararrays in cells,tissues and organisms[J].Nat Biotechnol,2003,21:1356-1360.

[收稿日期]2011-03-15 [修回日期]2011-05-25