腺相关病毒载体在阿尔茨海默病中的应用

[摘要] 探讨腺相关病毒载体在阿尔茨海默病中的应用。腺相关病毒载体是目前基因治疗中最常用的病毒载体，由于其具有定点整合、无致病性，通过一系列实验与研究，证明其可长期表达、免疫反应性小等独特的生物学特性。取得较为理想的前临床实验结果，重组腺相关病毒载体的进展为以后基因治疗带来了希望，为将来进入临床治疗打下了良好的基础。

[关键词] 腺相关病毒；阿尔茨海默病；开放阅读框；神经生长因子

[中图分类号] R749.1+6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2011）31-15-02

The Application of Adeno-associated Virus Load in Alzheimer’s Disease

GAO Huifang

Dehui People’s Hospital in Jilin Province, Dehui 130300, China

[Abstract] To explore the application of adeno-associated virus load in Alzheimer’s disease. Adeno-associated virus load is the one which is often used in gene therapy, because it owns the unique biological characteristics of integration on special spot, causing no other side effects. According to the results of a series of experiments and study, it can express itself forever and has little bad immune reaction. Its pre-clinic experimental result is ideal. Its advance of reorganization brings hope to future gene therapy and it lays a solid foundation for future clinic treatment.

[Key words] Adeno-associated virus; Alzheimer’s disease; Open reading frame; Nerve growth factor

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）载体是目前基因治疗中最常用的病毒载体。由于其具有定点整合、无致病性、可长期表达、免疫反应性小等独特的生物学特性，日益受到人们的重视。现针对腺相关病毒的生物学特性和其在阿尔茨海默病中的应用作一综述。

1 AAV的生物学特性

AAV属于微小病毒科、依赖病毒属，直径约25nm，无包膜，呈二十面体对称结构。当有辅助病毒如腺病毒等存在时，AAV才能够进行复制和装配，因而得名腺相关病毒。目前AAV已经有12种人源性血清型（AAV1～AAV12）和110多种非人灵长类动物源性血清型[1]被发现，其中，AAV2是目前研究最为透彻、应用最为广泛的血清型。

AAV2基因组[2]是长4.7kb的线性单链DNA，包含两个开放阅读框（open reading frames，ORFs）。左侧ORF编码复制调节基因rep，可产生4种Rep蛋白，即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。Rep78和Rep68是P5启动子的转录产物，分别通过非拼接和拼接的形式产生，是AAV各生命周期中重要的反式作用因子。在辅助病毒存在时，它们可以促进AAV基因的表达，反之则产生抑制作用，为AAV的复制所必需。由P19启动子转录、分别通过非拼接和拼接形式分别得到Rep52和Rep40蛋白，能够促进单链病毒DNA自聚，以利于其顺利为外壳蛋白所包被。右侧ORF编码cap基因，通过P40启动子转录产物的不同拼接形式，产生3种不同的病毒衣壳蛋白―VP1、VP2和VP3。在AAV2中，三种蛋白以1110的比例构成病毒衣壳。

ORFs两侧为长145bp的反向末端重复序列（inverted terminal repeats，ITRs）。ITRs是AAV的顺式作用元件，其外侧的125个核苷酸呈回文序列，可以通过碱基配对自身折叠形成一个“T”型的发卡结构（T-shaped hairpin structure）。ITRs中含有AAV DNA的复制起始位点（origin），其发卡结构中折叠部分可作为自身引物促进其复制过程中第二链的合成。在ITRs序列中含有Rep蛋白结合元件（Rep binding elements，RBEs）和末端解离位点（terminal resolution site，TRS），可与复制调节蛋白Rep结合，在从AAV复制起始到形成双链的整个过程中发挥关键作用。除复制外，ITRs在AAV基因组的包装、转录、非复制允许条件下的负性调控和点特异性整合等过程中也都是必不可少的。

AAV2可以通过与宿主细胞表面受体硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycan）结合进入细胞。此外，还有一些共受体可以增强细胞对AAV2的内摄作用。目前已知AAV2的共受体[3，4]有αVβ5整联蛋白（αVβ5 integrins）、纤维母细胞生长因子受体1（fibroblast growth factor receptor 1）、肝细胞生长因子受体（hepatocyte growth factor receptor）、αvβ1整联蛋白（αvβ1 integrin）和层粘连蛋白受体（laminin receptor）等。AAV感染宿主细胞后存在两种生活周期：溶解期（lytic stage）和溶源期（lysogenic stage）。在辅助病毒（腺病毒或单纯疱疹病毒）存在时，AAV进入溶解期，其基因组复制、表达并产生具有感染性的病毒颗粒。而当辅助病毒缺如时，AAV的复制和表达受到抑制，以潜伏感染的形式整合到19号染色体（q13.4）的长4.0kb的AAVS1区域中。定点整合能力是AAV独有的生物学特性，其机制与AAV基因组中的ITRs、Rep78或Rep68以及一段长138bp的整合效率元件[5]（integration efficiency element，IEE）有关。潜伏感染的野生型AAV在组织培养中不具有致病性。据统计，在人群中70%～80%的个体感染过AAV，但到目前为止临床上还没有因AAV感染而引起不良后果的报道。这是AAV的另一个独特的生物学特性。

2 AAV与阿尔茨海默病

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种发生于老年期或老年前期，以进行性认知障碍和行为损害为主的神经系统退行性疾病，是老年期痴呆的最常见类型。患者尸检显示脑组织萎缩，特别是海马和前脑基底部神经元缺失，组织病理学上的典型改变为β淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）沉积形成神经炎性斑（neuritic plaques，NPs）和神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）。其发病机制尚未完全明了。

AD在临床上以脑循环改善剂（如尼莫地平、氟桂利嗪等）、亲智能药（如甲磺双氢麦角胺、胞磷胆碱等）、神经递质相关药物（如多奈哌齐、美金刚、吡拉西坦等）及对症治疗为主，疗效有限。AD的基因治疗目前多致力于保护胆碱能神经元和减少Aβ的沉积等方面。

2.1 神经生长因子策略

AD认知和记忆功能障碍的主要解剖基础是海马组织结构的萎缩，功能基础主要是胆碱能神经兴奋传递障碍和中枢神经系统内乙酰胆碱受体变性、神经元数目减少等。目前采用的比较特异性的治疗策略是保护中枢胆碱能神经功能。

经大量研究证实，在AD动物模型中，给予神经生长因子（nerve growth factor，NGF）能够保护胆碱能神经元、改善疾病所致的行为异常。与传统的胆碱能保护药胆碱酯酶抑制剂（cholinesterase inhibitors，ChEIs）相比，NGF能够：①更有效地保护基底前脑胆碱能神经元（basal forebrain cholinergic neurons，BFCNs）；②增加残余BFCNs活力；③产生更多的乙酰胆碱（acetylcholine，Ach）而不具有剂量依赖性外周毒性；④能够保护和修复Ach传递的天然时空模式[6]。

对NGF的研究已有数十年的历史，其在体外及动物体内所取得的实验结果令人振奋，给AD等神经系统变性疾病的治疗带来了希望。人们试图将神经营养因子治疗策略在动物模型中取得的成功转化到临床应用上。目前，NGF已经用于糖尿病性周围神经病、HIV相关神经病和AD的临床试验中。然而，每一项临床试验的结果都令人失望，或未见疗效，或副作用明显。NGF在体内半衰期短，不能通过血脑屏障，因此，只有持续将药物直接作用于靶点才能达到治疗目的。因此，若要成功应用NGF治疗AD，必须满足以下两个条件：①能够有效作用于靶细胞并能够在靶作用点长期、稳定表达；②表达范围不能超过靶细胞以外的区域。Kathie M等提出利用AAV2携带人神经生长因子（CERE-110，AAV2-NGF），通过立体定向外科手术的给药方法作用于Meynert基底核（nucleus basalis of Meynert，NBM）[7]。结果表明，CERE-110可以准确在脑靶作用区域中表达；通过调整给药剂量，可以控制NGF的表达范围；NGF的表达在给药后的3、6、9和12个月时都可以在受试动物中观察到。目前，应用CERE-110治疗轻、中度AD的Ⅰ期临床试验业已开展。

2.2 疫苗治疗策略

老年斑是AD的特征性病理表现，其主要组成成分为β淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）。Aβ沉积与淀粉样蛋白前体（amyloid precursor protein，APP）的变异及其转化过程发生改变有关。减少Aβ沉积亦成为目前基因治疗的主要靶点之一。

AN-1792，由Aβ42肽和QS-21佐剂构成的世界上第一个Aβ疫苗，于1999年12月进入临床试验阶段。然而，在2002年1月，由于6%的受试者出现无菌性脑膜脑炎（aseptic meningoencephalitis），以致该试验在Ⅱa期时被提前中止。尸检发现，接种者脑中的Aβ明显减少，并可检测到浸润的CD4+ T淋巴细胞。这些结果证实，疫苗启动了小胶质细胞对Aβ的清除，但也同时激活了Aβ反应性自身免疫T细胞，并使其侵入中枢神经系统，介导了脑部的炎症反应。令人欣慰的是，获得抗Aβ抗体的受试者，与未获得者比较，其认知功能减退的速度明显降低，日常生活质量显著提高。因此，Aβ疫苗依然是一种充满希望的AD治疗策略，但必须要解决其所涉及的安全性问题。为此，科研人员开发了各种各样的技术，力求在增加特异性抗体产生的同时，尽可能地减少自身免疫性T细胞毒性作用。

腺相关病毒因为其本身的低免疫源性和无致病性为Aβ疫苗的应用开拓了新的思路。Zhang等利用腺相关病毒作为载体，尝试不同的给药途径，在AD转基因小鼠体内表达CB-Aβ42（霍乱毒素B亚基和Aβ42融合蛋白）。结果证明，这种AAV-CB-Aβ42诱导产生了可长期表达的高水平的Aβ特异性抗体，提高了小鼠的记忆和认知能力，减少了脑内Aβ的积聚和相关的星形胶质细胞增生。这些实验结果证实了AAV介导Aβ疫苗的安全性和有效性，相信会给AD的疫苗治疗带来新的生机。

2.3 其他

重组腺相关病毒载体还广泛用于其他各种AD基因治疗中。如其在细胞内抗体（intracellular antibodies）、脑啡肽酶（neprilysin，NEP）、载脂蛋白E基因（ApoE）等的应用中，都取得了较为理想的前临床实验结果，这为其将来进入临床治疗打下了良好的基础。

3 展望

基因治疗已经成为目前医学研究的热点。有效的基因治疗需要解决以下3个问题：①在分子水平上阐明疾病发生的机制；②找出治疗疾病的相关基因；③应用适合的载体通过合理的方法将目的基因导入靶细胞。目前用于基因治疗的载体分为两类：非病毒载体和病毒载体。前者包括裸DNA（purified DNA）、基因枪（shotgun）和脂质体-DNA复合物（lipid-DNA complexes）等。这些非病毒载体各具特色，但其基因传递和表达效率较低，不能满足人们的需要。目前主要的病毒载体包括逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒和腺相关病毒等。每一种病毒载体都各具有其优点和缺点。其中，腺相关病毒由于具有宿主范围广、能够定点整合入人类染色体、无致病性、可以稳定和长期表达、免疫源性小等特点，日益受到科学工作者的青睐。目前，rAAV已经成功地转导了肌肉、肝、脑、视网膜和肺等组织。有关rAAV载体介导的各种临床试验也正在开展中。此外，对AAV载体本身的改造亦没有停止，一系列的努力克服了AAV自身的局限性，极大地拓宽了它的应用范围。

基因工程的研究已经有数十年的历史，但是，到目前为止，还没有哪一种载体在基因治疗中是尽善尽美的，尽管重组腺相关病毒载体在多种疾病的病因学和动物实验中都取得了可喜的进展，但是以腺相关病毒作为载体的临床试验，其结果都不能令人满意。腺相关病毒载体还存在许多问题（例如免疫反应等）限制了它更为广泛的应用。关于基因治疗，我们还有很长的路要走。重组腺相关病毒载体的进展为基因治疗的明天带来了希望，还需要广大科研工作者不断地进行更为深入的研究。

[参考文献]

[1] 蔡炯，牛娜，李方，等. 腺相关病毒介导β淀粉样肽单链抗体对动物阿尔茨海默病的治疗效果[J]. 中国医学科学院学报，2011，33（2）：151-155，221.

[2] Daya S，Berns KI. Gene therapy using adeno-associated virus vectors[J]. Clin Microbiol Rev，2008，21（4）：583-593.

[3] 蔡炯，李方，王世真，等. 阿尔茨海默病患者β淀粉样肽40人单链抗体在大肠杆菌的表达和纯化[J]. 中国临床康复，2006，10（2）：114-116.

[4] 陈彪，马秋兰. 阿尔茨海默病病因学研究进展及治疗展望[J]. 中华神经科杂志，2003，36（2）：158-160.

[5] Singer O，Marr RA，Rockenstein E，et al. Targeting BACE1 with siRNAs ameliorates Alzheimer disease neuropathology in a transgenic model[J]. Nat Neurosci，2005，8（10）：1343-1349.

[6] Bishop KM，Hofer EK，Mehta A，et al. Therapeutic potential of CERE-110 （AAV2-NGF）: targeted, stable, and sustained NGF delivery and trophic activity on rodent basal forebrain cholinergic neurons[J]. Exp Neurol，2008，211（2）：574-584.

[7] Bard F，Cannon C，Barbour R，et al. Peripherally administered antibodies against amyloid beta-peptide enter the central nervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease[J]. Nat Med，2000，6（8）：916-919.

（收稿日期：2011-09-15）