新生大鼠皮层神经元原代培养及糖-氧剥夺损伤模型的建立

摘要：目的建立较为简便的新生大鼠皮层神经元细胞原代培养方法并建立糖-氧剥夺细胞损伤模型。方法取新生的大鼠（24 h）大脑皮层组织，消化后种植在多聚-L-赖氨酸包被的六孔培养皿上，用含10%胎牛血清DEME-HG液种植，4~8 h后换再用含有B27的Neurobasal培养基维持饲养。于不同时间点在倒置相差显微镜下观察形态变化，用免疫组化方法对神经元特异性标记物NSE染色鉴定。选取培养第7 d的神经元随机分为不作处理的对照组和过糖-氧剥夺建立细胞损伤模型组，Western blotting检测NSE蛋白表达。结果2~8 h神经元细胞贴壁，随着时间的延长，形态呈多变，突起逐渐增多，神经元突起间相互接触形成网络，培养7~10 d时神经元胞体最为丰满，通过免疫组化验证证明所分离培养的是神经元细胞。糖-氧剥夺细胞损伤模型组NSE蛋白表达量较对照组NSE蛋白表达量明显降低。结论该神经元方法简单易行，神经元纯度较高，并成功的建立糖-氧剥夺神经元损伤模型。

关键词：神经元；原代培养；neurobasal培养基；B27；糖-氧剥夺；细胞模型

神经元细胞培养技术是一种常用的技术，广泛用于神经系统疾病的细胞模型[1]，可为神经系统的发病机制和神经保护性药物的筛选提供良好的平台。在以往关于缺血/缺氧脑损伤的研究中，主要集中在动物体内研究，虽然在体试验更接近动物的实际状态，但易受到其他因素影响。体外原代培养神经元细胞，可以得到比较均一的细胞，可根据实验要求控制神经元细胞的生成，有利于动态观察神经元细胞的形态学变化，从而避免了体内研究的许多复杂因素的影响[2]。

1资料与方法

1.1一般资料 出生后新24 h内的SD大鼠，购于新疆医科大学实验动物中心； Neurobasal培养液、B27培养基添加剂、胎牛血清、0.25%胰酶、（life technology-GIBCO）；DEME高糖培养基（Hyclone）；神经元特异性烯醇化酶（NSE）多克隆抗体（abcam公司）；多聚-L-赖氨酸、SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒（北京中杉生物技术有限公司）。无血清培养基： Neurobasal培养基+2%B27培养基添加剂(50x)+1% L-谷氨酰胺(200 mmol/L)+ 双抗(100U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)，于冰箱4℃保存备用；多聚-L-氨酸包被液：用PBS液配制0.1 mg/mL多聚-L-氨酸溶液，0.22 μm滤器过滤除菌，4℃保存备用。

1.2方法

1.2.1大鼠皮层神经元的分离和培养 取24 h内新生的SD大鼠，采用颈椎脱臼处死小鼠后，放入盛有75%酒精的烧杯中消毒1～2 min。在无菌的环境下用剪刀迅速断头，用预冷的PBS液中漂洗干净移入另一个装有预冷H-DEME的容器内，充分暴露大脑皮层，在显微镜下剥尽皮层的脑膜及血管，将皮层组织剪成碎组织块，向剪碎的组织中加入浓度为0.05%的胰酶在37°C下进行消化，15 min后 终止消化作用。使用1 mL进口枪头对组织进行反复吹打（10次），注意动作要轻柔，且不可产生气泡。 将吹打后的细胞悬液转移入15ml的离心管中于4°C离心 1000 rpm，5 min，使用配制好的培养液对细胞进行重悬。200目筛网过滤，以1×106个细胞/mL，接种于经多聚赖氨酸包被的6孔培养板中，每孔加含10%胎牛血清的DMEM-HG培养液2 mL，置于37℃ 5%CO2培养箱中培养，4~8 h后用neurbasal+B27培养液换全液1次，以后每隔3 d半量换液1次。培养，4~8 h后用neurbasal+B27培养液换全液1次，以后每隔3 d半量换液1次。

1.2.2大鼠皮层神经元鉴定 免疫细胞化学方法验证神经元细胞的特异性和纯度皮层神经元培养到第7 d时，胞体发育饱满，取出爬片，选择NSE作为皮层神经元特异性标志物，按标准的免疫细胞化学染色法进行鉴定，按说明书步骤进行，以PBS缓冲液代替I抗作阴性对照。随机去3个视野计数阳性细胞百分数并照片。

1.2.3糖-氧剥夺损伤模型的建立 选取培养7 d的神经细胞，吸去培养基并用PBS液轻轻冲洗2遍，用95%氮气和5%二氧化碳气体饱和10 min后的无糖培养基造成缺糖环境，在充满氮气的37℃的细胞培养箱孵育45 min，然后换回原培养液，在37℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育6 h。

1.2.4 Western blotting检测神经元细胞的NSE蛋白表达水平 分别提取对照组和糖-氧剥夺组神经元蛋白提取，煮沸变性，电泳2 h，封-闭1~2 h，加一抗NSE (1∶500)、4℃过夜，加HRP标记抗兔二抗孵育1~2 h（1∶30000），曝光rad凝胶成像系统分析结果。

1.2.5统计学方法 运用SigmaStat 3.5统计软件，进行单因素方差分析，实验数据用表示，以P

2结果

2.1 SD大鼠原代培养皮层神经元的形态学观察在倒置显微镜下观察，刚种植的皮层神经元呈圆形、体积小、透亮、单个散在分布，见表1。2 h后开始有贴壁，8 h后大部分已贴壁。3~4 d细胞已有明显的增长的突起，以多级神经元为主，胞体为三角形、梭形、椭圆形、椎体形几不规则形。5~6 d后神经元细胞体进一步变大，突起增粗，连接形成网络。7~8 d时，细胞体积继续增大，胞体饱满，突起分支增大，形成致密网络。14 d细胞数量开始减少。经过氧-糖剥夺后的细胞从形态学观察贴壁能力下降，细胞间隙增大，遮光性降低，少数细胞坏死。

图1 体外培养不同时间大鼠皮层神经元形态观察

2.2免疫组化染色的观察结果，见图2 取第7 d的神经元细胞，NSE免疫组化染色（DBA显色），胞浆和突起被染成棕褐色而胞核不被染色的为阳性细胞，整个细胞都不被染色为阴性细胞，见图3C。在显微镜下进行观察，以3个视野中阳性神经元的数目占总细胞的比例为神经元纯度，经鉴定神经元纯度为90%左右。

2.3 Western blotting测定对照组和糖氧剥夺损伤组中细胞NSE和β-actin表达（图3）糖-氧剥夺细胞损伤模型组NSE蛋白表达量较对照组NSE蛋白表达量明显降低，差异无统计学意义（P

图2 皮层神经元特异性烯醇化酶免疫组化染色（×400）

图3 各组中NSE蛋白的表达（*与对照组比较P

3讨论

体外培养神经元是较困难的原代培养技术，为成功培养出神经元，首先应选用新生（24 h内）大鼠，因为刚刚出生的大鼠的神经元和神经胶质细胞均为分化成熟，可较容易养活。其次是组织块的消化、分离和接种的过程。必须严格控制胰酶的浓度和消化时间，可采用胰酶低浓度，延长消化时间来达到消化均一的效果，尽可能的减少机械损伤。再次是培养基的选择。血清培养的细胞状态很不均一，从正常到凋亡都有，严重影响试验准确，而无血清专用培养基所有的正常细胞都处于一样的状态，要么都好，要么都差，高度一致。无血清培养基neurobasal是较好的培养基。需要的添加剂为 B27，培养出的细胞状态均一，胶质细胞几乎不分裂。

在体外培养神经元基础上氧-糖剥夺模型是模拟在体缺血模型，又称"离体缺血模型，大致可分为：化学缺血模型和氧-糖剥夺模型。化学模型如氰化物可抑制养花磷酸化，从而阻断了ATP的产生。氧-糖剥夺模型采用去氧处理过的无糖培养基孵育细胞，再放入缺氧箱，使细胞处于缺氧、缺糖状态。细胞缺氧比较均一。离体细胞模型的实验条件容易控制、恒定，却可以在损伤过程中评价细胞功能，离体药物评价和筛选可直接作用细胞。本课题组采用用95%氮气和5%二氧化碳气体饱和10 min后的无糖培养基造成缺糖环境，在充满氮气的37℃的细胞培养箱孵育45 min，然后换回原培养液，在37℃ 5%CO2细胞培养箱中孵育6 h，造成一根缺血再灌注损伤模型。经过氧-糖剥夺后的细胞从形态学观察贴壁能力下降，细胞间隙增大，遮光性降低，少数细胞坏死，并通过Western blotting检测NSE蛋白表达。NSE主要存在中枢神经系统和神经分泌细胞中。在缺血/缺氧致神经元细胞损伤中，干扰了神经元的代谢变化，神经元细胞膜的功能和结构受损，NSE从胞浆中释放至细胞外，则细胞中NSE含量下降，NSE的含量可敏感的反应神经元损伤程度。在对照组和模型组中NSE蛋白表达的差异比较，氧-糖剥夺模型组NSE蛋白明显降低，差异有统计学意义。表示达到了缺血缺氧目标，较好的模拟了急性缺血对细胞的损伤模型。

参考文献：

[1]乔治・阿德尔曼．神经科学百科全书 [M]．神经科学百科全书翻译编辑委员译[M]．上海:伊克豪伊萨尔出版社,上海科学技术出版杜,1992:1043-1050．

[2]Mitchell P J, Hanson J C, Quets-Nguyen A T, et al. A quantitative method for analysis of< i> in vitro neurite outgrowth[J]. Journal of neuroscience methods, 2007, 164(2): 350-362.