一种大鼠蛛网膜下腔出血动物模型的建立

【摘要】目的：建立一种成年大鼠蛛网膜下腔出血（SAH）模型。方法：使用立体定位仪在显微操作下行枕大池两次注射静脉血建立大鼠SAH模型。术后第一天，4%多聚甲醛灌注后取脑。 脑组织用异戊烷－液氮快速冰冻并－80℃低温保存，行冰冻切片。MASSON染色观察蛛网膜下腔。结果：（1）动物模型实验成功率为83.33%；（2）MASSON染色显示脑膜的结构保存良好，蛛网膜下腔有大量的血细胞。结论：此实验为研究SAH提供了较好的动物模型。

【关键词】蛛网膜下腔出血；蛛网膜下腔纤维化；柔脑膜；MASSON染色

文章编号：1009-5519（2008）07-0956-02 中图分类号：R6 文献标识码：A

蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage SAH）是一种常见综合征，不仅可引起血管痉挛[1]，而且还可以引起蛛网膜下腔纤维化，甚至导致慢性脑积水的发生[2]，但机制尚不十分清楚，目前相关研究较少。柔脑膜是蛛网膜和软脑膜的合称，两者之间隔以蛛网膜下腔并以小梁相联系[3]。本研究成功地建立了一种成年大鼠SAH模型，为进一步研究SAH提供了较好的动物模型，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物：18只SD雄性成年大鼠，体重（200±10）g（由中南大学湘雅医学院动物部提供）。

1.2 主要试剂与仪器：Masson三色盒（珠海贝索生物技术有限公司），异戊烷（国药集团化学试剂有限公司提供），液氮、甲基纤维素（中南大学湘雅三医院病理科提供），手术显微镜及显微手术器械（上海医用光学仪器厂），脑立体定位仪（Narishge， Japan）

1.3 方法

1.3.1 动物模型的制作：术前禁食24 h，自来水饲养。用10%水合氯醛300mg/kg经右侧腹腔注射麻醉后，头颈部备皮及左侧腹股沟区备皮。仰卧位常规消毒铺巾，切开左侧腹股沟区皮肤，找到左侧股静脉并置管备用；取俯卧位使用立体定位仪固定大鼠，颈部稍屈。常规消毒铺巾，参照Konczalla方法[4]，在显微镜下沿头颈部交界处作一长约3~4 mm的纵切口，暴露环枕筋膜，先用0.45号注射针头（针尖需较钝）固定在立体定位仪纵臂上，垂直穿刺枕大池，抽出清亮脑脊液0.1 ml后，从原股静脉置管处抽0.2 ml新鲜血缓慢注入枕大池，注射完后留针5 min，拔针后用医用耳脑胶封闭针眼，缝合切口。青霉素腹腔注射抗炎，头低位放置30 min。术后24 h再次以同样的方法注射0.2 ml股静脉血。生理盐水组操作与实验组完全相同，但两次注射均以生理盐水代替自体血。

1.3.2 取材：腹腔麻醉下灌注固定，室温下保存30 min后断头仔细咬除颅骨取出硬膜及脑组织。甲基纤维素糊状液包埋组织。采用异戊烷－液氮快速冷冻，即将盛异戊烷的金属小杯放入盛有液氮的大杯中，见异戊烷有白色糊状物出现时放入组织包埋块[5]，约20秒后见组织包埋块变白变硬后取出（注意处理时间勿过长，时间过长会使组织变脆裂开，导致切片时不能成片）。冰冻组织块置- 80 ℃冰箱中保存待测。

1.3.3 切片：在顶部正中处行冠状冰冻切片，厚度为12 ?滋m。切片于室温下放置1天，待切片干后，严格按试剂盒步骤进行MASSON染色。

2 结果

在制作SAH动物模型过程中，实验组不能耐受第一次手术死亡1只，不能耐受二次手术死亡2只，动物模型实验成功率为83.33%。MASSON染色显示脑膜的结构保存良好，蛛网膜下腔有大量的血细胞（见图1、图2）。

3 讨论

迄今报道的SAH动物模型主要用于研究脑血管痉挛变化，而研究SAH后蛛网膜下腔纤维化及脑积水的较少见。由于枕大池空间大，颅压升高相对缓慢，目前枕大池两次注血法被认为是较成熟的模型。但枕大池穿刺可能直接损伤脑干致死，死亡率相当较高[5]。我们在以下几方面加以改进：（1）在立体定位仪上，使用显微操作，能在最小损伤下充分暴露环枕筋膜，并减少穿刺的盲目性。（2）使用立体定位仪机械穿刺有利地减少了损伤脑干的可能。（3）抽出清亮脑脊液0.1ml再缓慢注血避免急性颅高压。（4）延缓拔针，术后用耳脑胶封针孔，防止注射的血液溢出。（5）实验过程严格的无菌操作并术后抗炎防止颅内感染。我们动物模型实验提高了成功率，减少了创伤，降低了死亡率。

我们认为，两次枕大池注射自体血及脑组织冰冻切片后行MASSON染色，能较好地保存蛛网膜下腔结构，是研究SAH后柔脑膜病理变化可行的实验方法，并且实验相对简单，可操作性强。

参考文献：

[1] Bassiouni H，Schulz R，Dorge H，et al. The impact of subarachnoid hemorrhage on regional cerebral blood flow and large-vessel diameter in the canine model of chronic vasospasm[J].Stroke Cerebrovasc Dis，2007，16(2):45.

[2] Whitelaw A，Cherian S，Thoresen M. Posthaemorrhagic ventricular dilatation: new mechanisms and new treatment[J].Acta Paediatr Suppl，2004，93(444)：11.

[3] 成令忠，钟翠平，蔡文琴. 现代组织学[M]. 第一版.上海：上海科技文献出版社，2003.456.

[4] Konczalla J，Vatter H，Weidauer S，et al. Alteration of the cerebrovas-cular function of endothelin B receptor after subarachnoidal hemor-rhage in the rat [J].Exp Biol Med (Maywood)，2006，231(6)：1064.

[5] 金清东，陈 志，林秋泉，等.蛛网膜下腔出血动物模型的研究进展[J].现代医药卫生，2007，23(12)：1009.

收稿日期：2007-12-11