兔抗乐果抗血清制备的初步实验研究

【摘要】目的：对制备兔抗乐果抗血清进行初步研究。方法：采用生产乐果的中间体硫磷酯与1，4-二氨基丁烷反应合成乐果半抗原，利用碳二亚胺法，将半抗原与牛血清白蛋白（BSA）及卵清蛋白（OVA）偶联，分别制备免疫原和包被原。将合成的免疫原免疫新西兰白兔6次，制备抗乐果的抗血清。用间接ELISA检测抗血清的效价，用间接竞争ELISA检测与其他结构类似物的交叉反应率。结果：通过偶联，获得免疫原和包被原，半抗原与BSA和OVA的偶联比分别为13∶1和11∶1。免疫原免疫新西兰白兔获得的抗乐果抗血清效价分别为1∶256和1∶128；与氧化乐果的交叉反应率为23％，与其他所测结构类似的农药交叉反应率均小于2％。结论：通过免疫原免疫新西兰白兔，获得抗乐果的抗血清，但其抗血清效价较低，与制备检测试剂盒的要求尚存在较大的差距。

【关键词】乐果；抗血清；效价；交叉反应

文章编号：1009-5519（2008）07-0951-02 中图分类号：R392 文献标识码：A

Preliminary research on preparation of anti-serum against dimethoate

ZHANG Wen-yuan，YANG Ya-dong，FANG Guo-jian

(Institute of Biological Engeneering，Zhejiang Academy of Medical Sciences，Hangzhou 310013 China)

【Abstract】Objective：To prepare the anti-serum against dimethoate.Methods：Hapten of dimethoate was synthesized，then it was conjugated to bovine sera albumin(BSA) and ovalbumin(OVA) to prepare immunogen and coating antigen respectively by carbodiimide metnod.Anti-serum against dimethoate was prepared from New Zealand white rabbits immunized with immunogen. Titers of anti-serum against dimethoate were determinated with indirect ELISA，and cross reactivities of anti-serum were determinated with indirect competitive ELISA.Results：Anti-serum obtained from rabbits immunized with immunogen displayed low titers and showed certain cross reactivity for omethoate and weak cross reactivity for other several analogous compounds.Conclusion：Anti-serum against dimethoate was obtained in this experiment，but its titer was low so that it is not up to standard enough to prepare kit using the anti-serum.

【Key words】Dimethoate；Anti-serum；Titer；Cross reactivity

1 材料和方法

1.1 试剂和实验动物：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均为Sigma 产品，牛血清白蛋白（BSA， MW67000）、卵清蛋白（OVA，MW45000）、1，4-二氨基丁烷均为Fluka产品， HRP标记的羊抗兔IgG为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。新西兰白兔，雄性，体重2 kg左右，浙江省实验动物中心提供， 实验动物质量合格证：SCXK（浙）2003-0002号。乐果原药及中间体来自杭州庆丰农化有限公司，各农药标准品为北京舒伯伟化工仪器有限责任公司产品。

1.3 人工抗原制备：采用碳二亚胺法，将半抗原与牛血清白蛋白（BSA）及卵清蛋白（OVA）偶联，分别制备免疫原和包被原。其中半抗原-BSA为免疫原，半抗原-OVA为包被原。

光谱法测定半抗原、免疫原、包被原、BSA、OVA的吸光值，按文献[2]测定半抗原与载体蛋白的偶联比。

1.4 动物免疫及抗血清制备：首次免疫用免疫原与等量弗氏完全佐剂进行乳化，按0.5 mg/kg体重剂量于兔背部皮内及皮下多点注射。以后每隔3周，用免疫原与等量弗氏不完全佐剂混匀后，加强免疫。先后共免疫6次，共有6只雄性兔子进行免疫。末次免疫后10天心脏采血，分离血清，即为抗血清，-20℃保存。

1.5 抗乐果抗血清效价测定：采用方阵滴定法确定抗血清最佳工作浓度与包被原最佳包被浓度，间接ELISA测定血清抗体效价。抗血清经稀释后，加入到用包被原包被的酶标板中，孵育、洗涤后，再加入HRP标记的羊抗兔IgG。间接ELISA测定效价。检测结果为OD490值≥阴性对照的2.1倍为阳性。

1.6 交叉反应率测定：用间接竞争ELISA测定抗血清与其他结构类似物农药氧化乐果、敌敌畏、敌百虫、甲胺磷、马拉硫磷之间的交叉反应率。将供试物按一定的浓度稀释，建立它们的抑制标准曲线，并计算各自的IC50，再计算交叉反应率。

交叉反应率（CR）=IC50(乐果)/IC50(结构类似物)×100％

2 结果

2.1 免疫原和包被原的合成：本实验用碳二亚胺法将乐果半抗原分别与BSA和OVA偶联，分别制备免疫原和包被原。偶联物中半抗原与BSA和OVA的结合比分别为13∶1和11∶1。

2.2 抗乐果抗血清效价测定结果：本实验共免疫6只雄性兔子，间接ELISA测定抗血清抗体效价（P/N≥2.1），4只免疫的兔子未产生抗体，另外2只兔子产生抗血清抗体效价为1∶256及1∶128，抗体效价较低，与制备检测试剂盒的要求尚有较大的差距。

2.3 交叉反应率的测定：通过间接竞争ELISA测定，该抗血清与氧化乐果具一定的交叉反应率，为23％，与其他所测结构类似的农药交叉反应率均小于2％。

3 讨论

一般农药分子量小于1000，缺乏T细胞表位，无法直接诱导动物机体产生特异性抗体，即无免疫原性。因此，首先需要农药的结构特征合成半抗原，再将半抗原与载体蛋白偶联合成人工抗原。然后将人工抗原免疫动物及用杂交瘤技术制备针对待测农药小分子的抗血清及单克隆抗体，再进一步制备农药的快速检测试剂盒。自上世纪80年代初，Hammock等[3]首先将免疫分析法用于检测农药残留。Vallejo等[4]于1982年将农药对硫磷与牛血清白蛋白结合制备人工抗原，再将人工抗原免疫兔子产生抗血清，再用ELISA法可检测对硫磷。Ibrahim等[5]采用杂交瘤技术制备出抗对硫磷的特异性单克隆抗体（McAb），用ELISA法检测对硫磷含量，最低检测量可达1 ng/ml。

农药残留的免疫分析法是近年来发展起来的分析技术，其突出优点是前处理过程大为简化，并能达到快速、简便的现场检测要求，正成为一个研究热点[6，7]，并显示出独特优势。一般情况下，结构较复杂（如含有环状结构）、分子量较大的半抗原在进一步实验中较易获得免疫成功。Chappey等[8]研究表明，分子量小于300的半抗原难以获得高亲和力的抗体。尤其是没有环状结构（如没有芳香环、杂环等）或结构不够复杂的半抗原更难于诱导动物产生抗体。但也有获得成功的。Tuomola等[9]用一个分子量很小的化合物（分子量为131.2）3-甲基吲哚的羰基与适当较长的连接臂连接，合成9个半抗原，通过进一步实验、筛选得到特异性单克隆抗体。草铵膦（Glufosinate）是分子量很小的除草剂，利用衍生协同的免疫分析法（DAIA），通过同型双功能交联剂辛二酸双（N-羟基琥珀酰亚胺酯）成功构建N-乙缩醛草铵膦活性半抗原[10]。甲胺磷为无环状结构的有机磷农药，孙远明等[11]偶联氧、硫二甲基硫代磷酰氯到牛血清白蛋白上，通过实验成功制备分泌抗甲胺磷抗体的单克隆细胞株，获得了好的免疫效果，并可用于检测甲胺磷的研究。董国伟等[12]制备出高效价的兔抗甲胺磷的多克隆抗体。

乐果是最广泛使用的有机磷农药之一，乐果分子量小，为229，且分子内无环状结构，其残留量主要是通过理化分析方法检测，尚未见免疫分析法的报道。本实验尝试利用生产乐果的中间体硫磷酯与1，4-二氨基丁烷反应合成乐果半抗原，再将半抗原与载体蛋白连接后合成人工抗原。通过人工抗原免疫兔子，制备抗乐果抗血清抗体。但制备的抗血清效价低，与制备试剂盒的要求尚存在较大的差距。本实验存在以下诸多问题：（1）可能由于半抗原分子量低且分子内无环状结构，使动物免疫系统对半抗原的识别和记忆能力较弱，使得人工抗原免疫动物较难成功，6只兔子免疫后4只不能产生抗体，而能产生抗体的2只兔子其抗血清效价也低。（2）制备半抗原时，部分1，4-二氨基丁烷的两个氨基可能都与硫磷酯反应，为了避免与减少这种情况，本实验采取将硫磷酯滴于1，4-二氨基丁烷中，进行反应。（3）乐果半抗原生成反应较复杂，产生的副产物会影响半抗原的纯度和质量，而免疫原的纯度和质量对产生的抗体质量的影响较大。制备高效价和高质量的抗体是免疫分析法的关键。而本实验得到的抗乐果抗血清效价较低，尚未达到制备检测试剂盒的要求，存在的差距较大。我们曾经用同样的人工抗原免疫BALB/c小鼠，通过细胞融合、杂交瘤技术对乐果单克隆抗体的制备进行了初步研究，获得的单克隆抗体效价、亲和力都较低，与制备试剂盒的要求尚有较大的差距，与本实验存在的情况和问题相似。为了提高免疫原性和抗血清抗体效价，今后应考虑寻求商品化的更适合合成半抗原的化合物，以及寻求更好的半抗原衍生方式、偶联位点、连接臂长、偶联比，以及增加免疫次数、延长免疫时间等作进一步研究，以提高抗血清的效价和质量。

参考文献：

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收稿日期：2007-12-28