Livin和bcl-2 p53基因在宫颈癌组织中表达相关性的初步研究

作者：李爱竹，肖德乾，黄红梅，林琼燕，方林彬

【摘要】 目的：探讨新的凋亡抑制基因livin在宫颈癌组织中的表达，及其与bc1-2和p53表达的相关性。方法：应用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接法(SP法)，检测livin、bcl-2、p53基因在lO例正常宫颈组织及57例宫颈癌组织中的表达。结果：Livin基因在正常宫颈组织中不表达，57例宫颈癌组织中,40例表达阳性，占70.1％。Livin基因表达阳性率与宫颈癌的病理分级和临床分期有关。宫颈癌组织中p53蛋白表达阳性、阴性者中，livin基因表达阳性率分别为76．7％(33／43)、21.4%(3/14)，两者比较，差异有统计学意义(P<0.05)；bcl-2蛋白表达阳性、阴性者中，livin基因表达阳性率分别为87.8％(36／41)、25%(4/16)，两者比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：Livin基因的异常表达而引起的细胞凋亡抑制，在宫颈癌的发生中起一定作用,其表达与宫颈癌组织中p53、bc1-2蛋白的异常表达密切相关。

【关键词】 bcl-2； p53； 宫颈肿瘤； 免疫组织化学

Livin(又称KIAP，ML-IAP)是一种新发现的IAP(凋亡抑制蛋白)家族成员，其表达与肿瘤的发生、发展密切相关。livin基因在正常组织中不表达，而在许多被研究的肿瘤组织中呈阳性表达，因此为肿瘤的诊断和治疗提供了新的靶点。本研究着重探讨新的细胞凋亡抑制基因livin在宫颈癌组织中的表达及其与bcl-2和p53表达的关系。

1 资料与方法

1.1 资料：选择我中心1999年至2005年间经病理检查证实的宫颈癌患者57例，取其放射治疗前的活组织检查标本，用4％甲醛固定，石蜡包埋，连续切片。留1张行苏木素伊红(HE)染色复诊。57例宫颈癌患者均为鳞癌，年龄31～70岁，平均52.3岁。病理分级：C1级7例，C2级23例，C3级27例。根据1985年再次修订后的国际妇产科联盟(FLGO)提出的分期标准进行临床分期：Ⅱb期14例，Ⅲa 期1例，Ⅲb 期42例。肿瘤生长类型：菜花型31例，结节型19例，溃疡型5例，混合型2例。另取l0例正常宫颈组织作为对照。

表1 宫颈癌患者临床病理及bcl-2、p53蛋白表达与livin基因表达关系（略）

1.2 方法：采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接(SP)免疫组织化学方法。一抗为鼠抗人livin单克隆抗体(Imgenex公司生产，可检测livin-α和livin-β，购于美,1:50)、bcl-2兔抗人多克隆抗体(sc-492)、P53鼠抗人单克隆抗体(D0-1，sc-126)为美国Ssnta Cruz公司产品；SP试剂盒为美国Zymed公司产品，一抗工作浓度均为1:30。实验步骤按试剂盒说明书进行。将已知的乳腺癌切片作为阳性对照，用磷酸盐缓冲液代替一抗，作为对照。

1.3 结果判定：在组织切片中显示胞核或胞浆染为淡黄至黄棕色者为阳性细胞标志。将阳性细胞按其数量及显色强度分为3级：表达弱阳性(+)，即阳性细胞数<10％，显色强度为淡黄色或仅个别细胞呈黄至棕黄色染色；表达强阳性(+++)，即阳性细胞数>60％，多数细胞呈黄至棕黄色染色；表达中度阳性(++)，即阳性细胞数及显色强度介于弱阳性与强阳性之间。凡显色强度与背景无明显差别者为阴性。

1.4 统计学处理：采用X2检验。

2 结果

2.1 宫颈癌组织中livin基因的表达：Livin基因表达阳性染色主要定位于肿瘤细胞胞浆中，为粗细不一的棕黄色颗粒。正常宫颈组织中未见Livin基因表达，而57例浸润癌中40例livin基因表达阳性，占70.1％。

2.2 宫颈癌组织中livin基因表达与临床病理的关系：Livin基因阳性表达与患者年龄、肿瘤生长类型无关 (P >0.05); livin基因的表达随宫颈癌临床分期的增加而增高,两者比较有统计学意义(P<0.05); 宫颈癌细胞分化程度越低, livin基因阳性表达率越高, 两者比较有统计学意义(P<0.05)见表1。

2.3 宫颈癌组织中livin基因表达与bcl-2、p53蛋白表达的关系：bcl-2蛋白阳性产物主要定位于细胞浆中。57例宫颈癌组织中41例呈阳性表达，占71.9％。41例bcl-2蛋白阳性表达者中，36例livin基因表达阳性，占87.8％ ，16例bcl-2蛋白阴性表达者中4例livin基因表达阳性，两者比较具有统计学意义(P<0.05)。p53蛋白免疫反应产物积聚在肿瘤细胞核中。宫颈癌组织中livin基因表达与p53蛋白表达密切相关，p53蛋白表达阳性、阴性者中，livin基因表达阳性率分别为76．7％(33／43)、21.4%(3/14)，两者比较有统计学意义(P<0.05) 见表1。

3 讨论

Livin基因是近来分离的哺乳动物凋亡抑制蛋白与bcl-2相似，livin基因过度表达抑制了细胞凋亡，从而有利于细胞的异常增殖和恶性转化。近年来研究认为，livin抗凋亡的作用机制主要是：①直接抑制caspase或procaspase：Caspase蛋白酶家族在细胞凋亡发生过程中的各个阶段都发挥重要作用。Livin可以和下游caspases的活性形式caspase-3和caspase-7直接作用，也可以直接抑制procaspase-9的活化过程，使无活性的procaspase-9不能活化成有活性的caspase-9，而且livin也可以直接抑制活化的caspase-9的功能从而发挥抗凋亡的作用［1］。②TAK1依赖的JNK1的激活：近年来有很多研究表明JNK1途径在IAP抗凋亡过程中发挥重要作用。Sanna等［2］发现XIAP 、NIAP和livin通过选择性激活由TAB1／TAK1介导的MAP激酶JNK1，明显抑制由TNF-a和ICE诱导的凋亡，这种抗凋亡途径独立于caspase途径。NAIP和livin对JNK1的活化过程能够被催化灭活的TAK1所阻断，故认为TAK1依赖的JNK1的激活可能是lAP家族抗凋亡的另一机制。

从本实验结果可见，livin基因的表达与bcl-2、p53蛋白异常表达密切相关。bcl-2基因通过阻止细胞色素c从线粒体向胞质释放而对细胞凋亡起调节作用，这一环节处在半胱氨酸蛋白酶caspase级联反应上游。livin基因阻断细胞凋亡的途径是通过直接作用于细胞凋亡途径中的终末效应酶—半胱氨酸蛋白酶easpase-3、easpase-7。在宫颈癌中，这两条对抗细胞凋亡的途径可能会协同作用。p53基因是重要的细胞凋亡调控基因，在转录水平上，野生型p53对bcl-2基因的表达有下调作用。是否这种转录水平的抑制也对livin基因起作用，从目前的证据看，p53基因在大多数人类肿瘤中存在高频率突变，而livin基因也在不同肿瘤中存在高表达。本研究表明，livin基因高表达的宫颈癌组织中p53基因存在高频率突变，推测这是由于p53基因突变而丧失了对livin基因表达的下调作用所致。livin基因高表达的肿瘤凋亡阈值升高，同时还与肿瘤耐药性和放射治疗敏感性有关［3～5］。因此，检测宫颈癌组织livin的表达，不仅为判断宫颈癌的生物学特性提供了重要依据，亦对宫颈癌的基因治疗提供新的靶点，具有重要的基础研究和临床指导意义。从本实验中看，livin基因的表达与宫颈癌的病理分级及临床分期有密切的关系，在宫颈癌预后判断中的价值如何，应在我们随后的临床跟踪实验中得到证实。

【参考文献】

［1］ Gary M. Kasof and Bruce C. Gomes.MECHANISMS OF SIGNAL TRANSDUCTION:Livin, a Novel Inhibitor of Apoptosis Protein Family Member［J］. Biol Chem, 2001，276:3238-3246.

［2］ M. Germana Sanna, Jean da Silva Correia, Odile Ducrey, et al.CELL GROWTH AND DEVELOPMENT:IAP Suppression of Apoptosis Involves Distinct Mechanisms: the TAK1/JNK1 Signaling Cascade and Caspase Inhibition［J］.Mol Cell Biol, 2002，22:1754-1766.

［3］ Andersen MH，Reker S，Becker JC，et a1．The melanoma inhibitor of apoptosis protein：a target for spontaneous cytotoxic T cell responses［J］．Invest Dermatol，2004，122(2)：392-399．

［4］ Hersey P.Apoptosis and melanoma：how new insights are effecting the development of new therapies for melanoma［J］．Curr Opin Oncol，2006，18(2)：189-196．

［5］ Kim DK,Alvarado CS,Abramowsky CR,et a1.Expression of inhibitor-of-apoptosis protein (1AP) livin by neuroblastoma cells：correlation with prognostic factors and outcome ［J］． Pediatr Dev Pathol，2005，8(6)：621-629．