大豆异黄酮和壬基酚对雄性大鼠生殖系统的联合作用

摘要： ［目的］ 探讨大豆异黄酮、壬基酚联合孕期暴露对雄性子代大鼠生殖系统的危害。 ［方法］ SD大鼠同笼获取40只孕鼠。将孕鼠随机分为5组：对照组（A）、200 mg/kg壬基酚组（B）、200 mg/kg 壬基酚＋50 mg/kg 大豆异黄酮组（C）、200 mg/kg 壬基酚＋150 mg/kg 大豆异黄酮组（D）、200 mg/kg 壬基酚＋450 mg/kg 大豆异黄酮组（E）。孕期灌胃染毒，对其子一代雄鼠90天龄剖杀检测其数量、质量，组织重量、酶活性等。 ［结果］ 与A组比较，B组重量和系数、活动度、附睾尾计数、每日生成量、组织碱性磷酸酶（ALP）、乳酸脱氢酶（LDH）和血清睾酮（TT）水平显著下降，壬基酚与各剂量大豆异黄酮联合作用组重量、活动度、附睾尾计数、每日生成量、ALP、TT水平均显著下降；与B组比较，C组的重量、系数、每日生成量、ALP、LDH水平均显著升高，E组重量、系数、每日生成量、ALP、LDH显著升高而平均窝活产只数、活动度睾酮水平表现出下降的趋势。 ［结论］ 50 mg/kg大豆异黄酮对壬基酚所致雄性生殖系统危害似具有拮抗作用。450 mg/kg的大豆异黄酮对壬基酚的雄性生殖系统危害似表现出相加作用。

关键词：异黄酮；壬基酚；生殖；SD大鼠

The Joint Action of Nonylphenol and Soy Isoflavone on the Reproductive System of Male RatsZHOU Yuan-zhong，SHEN Xu-bo，XU-Jie，FAN Qi-yuan*（Department of Preventive Medicine，Zunyi Medical College，Zunyi 563000，China）

Abstract：［Objective］ To explore the combined adverse effects of nonylphenol and soy isoflavone on the male offspring reproductive in rat. ［Methods］ 50 pregnant rats were randomly divided into five groups（A：control group，B：nonylphenol group（200 mg/kg），C：nonylphenol+ low soy isoflavone dose（50 mg/kg）group，D：nonylphenol +middle soy isoflavone dose（150 mg/kg）group，E：nonylphenol +high soy isoflavone dose（450 mg/kg）group）. Different dose of soy isoflavone and nonylphenol were administered to pregnant rats in each group by gavage（as a solvent，only peanut oil was delivered to control group）during the period from 13th to 19th day of pregnant. F1 offspring（male）were selected and sacrificed on 90th day and their reproductive system was examined. ［Results］ Compared with the control group，the activities of sperm，the sperm count in the tail of epididymis，the gonepoiesis quantity per day of the left testis ，the weight and coefficient of testis，as well asALP，LDH and TT in the group of soy isoflavone＋nonylphenol administered rats decreased significantly. Compared with nonylphenol treated group，the weight and coefficient of testis，the gonepoiesis quantity per day ，ALP and LDH indices of F1 male rats in the nonylphenol + 50 mg/kg soy isoflavone treated group increased significantly；the weight and coefficient of testis，the gonepoiesis quantity per day，ALP and LDH increased significantly，but the activity of sperm，the quantity of living offspring and TT showed the trend of decrease in the nonylphenol + 450 mg/kg soy isoflavone treated group. ［Conclusion］ Nonylphenol might cause hazards on the F1 male in differentiation period of reproductive system. The nonylphenol and 50 mg/kg soy isoflavone could show antagonistic effects，but the nonylphenol and 450 mg/kg soy isoflavone show additive actions on F1 male reproductive system of rats.

Key Words：isoflavone；nonylphenol；reproductive；SD rats

壬基酚聚氧乙烯醚（nonylphenol polyethoxylates，NPEs）作为非离子表面活性剂，被广泛应用于洗涤剂、乳化剂、造纸工业［1］。NPEs 在环境中降解产生壬基酚（nonylphenol，NP）。由于NP的高度疏水性，使其易于在水体下的淤泥中浓集；而在厌氧环境下，NP相当稳定，不易降解，所以造成NP在水环境中广泛分布。文献报道，NP作为一种典型的环境内分泌干扰物（EDs），对生殖系统的危害是可以肯定的［2-7］。中国人历来有喜用大豆及大豆制品的习惯，大豆制品种类繁多，使用量大。大豆异黄酮是一种公认的具有保健作用的产品，同时有文献证实其具有雌激素样作用和对雄性生殖系统的危害作用［8］。但尚未见文献报道大豆异黄酮与NP的联合作用效应和性质。本实验采用大豆异黄酮和NP联合孕期暴露，观察其对子一代（F1）雄性大鼠生殖系统的影响，初步探索在生殖系统发育最敏感期，大豆异黄酮和NP联合作用对雄性生殖系统的影响，为全面评价环境内分泌干扰物对人类生殖系统的影响提供研究依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

清洁级SD大鼠雄性25只，体重（250±20）g；雌性50只，体重（200±20）g。由第三军医大学野战外科研究所动物室提供，动物合格证号：SCXK（渝）20020003。

1.2 主要试剂和仪器

NP（常州染料化工厂，纯度> 98.5%）；大豆异黄酮（华北制药股份有限公司，纯度> 99%）；睾酮-19位测试盒（北京北方生物技术研究所）；OLYMPUS 270全自动生化分析仪配套试剂。OLYMPUS 270全自动生化分析仪；GC-2010型10探头γ放射免疫计数器（中科大中佳公司）。

1.3 动物处理

50只雌性SD大鼠按2 : 1与雄性大鼠同笼，次日晨将雌鼠逐一阴道涂片镜检，发现当日记为孕期0天（E0），以后依次为E1，E2……E21，将所获40只孕鼠随机分到以下5组，每组8只。A：空白对照组；B：壬基酚组（200 mg/kg）；C：壬基酚（200 mg/kg）＋低剂量大豆异黄酮组（50 mg/kg）；D：壬基酚（200 mg/kg）＋中剂量大豆异黄酮（150 mg/kg）；E：壬基酚（200 mg/kg）＋高剂量大豆异黄酮（450 mg/kg）。在孕鼠的E13 ～E19期间，以花生油为溶剂，每天灌胃染毒。生产后记录F1平均窝活产只数，雌雄比例。F1雌鼠舍弃，F1雄鼠每窝减窝至3只，饲养至90天龄时，各剂量组F1雄鼠均随机抽取10只称重，断头取颈动脉血，剖杀取，检测各指标。

1.4 操作步骤

取一侧称重并计算系数（重量×100%/体重）。取另一侧附睾，准确称重，用冷的营养液冲洗干净，将其放入盛有营养液（NaC1：8 g，KC1：0.2 g， KH2PO4 ：0.2 g，Na2HPO4・12H20 ：2.9 g，加双蒸水至1 000 m1）l ml、预温37℃的称量杯中，用眼科手术剪快速剪碎，吹打混匀，制成悬液，用100目滤网过滤，再加9 ml 的37℃ 营养液稀释混匀，将悬液置于37℃ 温箱孵育15 min使充分游离，用作附睾尾计数。取半个，称重、剪碎，于STI液（氯化钠：0.9%，硫柳汞：0.01%，Triton-X-100：0.05%）中用内切式组织匀浆器高速匀浆1 min，适当稀释后用血球计数板计数不能被破坏的细胞头数，结果除以6.1即可算出每克每日生成量［7］。组织碱性磷酸酶（ALP）和乳酸脱氢酶（LDH）采用全自动生化分析仪测定。颈动脉血血清睾酮（TT）测定按测试药盒的说明书提供的方法测定。

1.5 统计处理

本资料采用SPSS 11.0软件进行统计学处理和分析，进行方差齐性检验和正态性检验后，资料呈正态性分布且方差齐者，采用t检验及方差分析，差异有显著性者，进一步作q 检验。

2 结果

2.1 孕期染毒对F1出生指标的影响

B组及E组子代大鼠毛发光泽度稍差，较其他组精神萎靡，但未出现死亡情况。A组及B、C 组子代大鼠皮毛光滑，活动良好，未观察到异常情况。平均窝活产只数、平均窝雄鼠只数、平均窝雌鼠只数、雌雄比例在各组间差异未见统计学意义。

2.2 对F1雄鼠重量和系数的影响

与A组比较，B组重量、系数下降具有统计学意义（P < 0.01），各剂量大豆异黄酮+NP组重量降低具有统计学意义（P < 0.01）。

与B组比较，各剂量大豆异黄酮+NP组重量、系数升高具有统计学意义（P < 0.05）。

其余差异未见统计学意义（P > 0.05）。结果见表2。

Δ：与B组相比（Vompared with group B），P < 0.05，ΔΔ：P < 0.01

2.3 对F1雄鼠数量和质量的影响

与 A 组比较，B组活动度、附睾尾计数、每日生成量下降具有统计学意义（P < 0.01 ）；各剂量大豆异黄酮+NP组活动度、附睾尾计数、每日生成量下降具有统计学意义（P < 0.05）。

与B组比较，C组活动度升高具有统计学意义（P < 0.05）；D组、E组每日生成量升高具有统计学意义（P < 0.05）。

其余差异未见统计学意义（P > 0.05）。结果见表3。

2.4 对F1雄鼠酶活性和血清睾酮的影响

与A组比较，B组ALP、LDH、TT下降具有统计学意义（P < 0.01）； 各剂量大豆异黄酮＋NP 组ALP、TT 下降具有统计学意义（P < 0.05）。

与B组比较，C组ALP 、LDH升高具有统计学意义（P < 0.01）；D组LDH升高具有统计学意义（P < 0.01）；E组ALP、LDH升高具有统计学意义（P < 0.01）。

其余差异未见统计学意义（P > 0.05）。结果见表4。

3 讨论

研究已经证实NP和大豆异黄酮都分别对F1大鼠雄性生殖系统具有危害作用［6-8］，但由于人类居住的环境是一个复杂的生态体系，在这个体系中，各种物质交互作用于人体，几乎不存在不受其他因素影响的某种单一因素单独作用于人体的情况，因此研究多种因素之间的联合作用有重要的意义。本研究用已证实有明显雄性生殖危害作用剂量的NP与不同剂量大豆异黄酮组的联合作用，观察孕期接触NP和大豆异黄酮对子代雄性生殖系统的影响，研究二者联合作用性质。

结果表明 50 mg/kg 的大豆异黄酮和NP的共同作用与 NP 单独作用相比较，能显著提高重量和系数，提高活动度及ALP和 LDH 水平；附睾尾计数和每日生成量的升高虽然无统计学意义，但均有所升高。实验结果说明，大豆异黄酮和 NP 联合，其对生殖系统的毒性作用小于 NP 单独作用，50 mg/kg 的大豆异黄酮对 NP 所致生殖系统危害毒性具有拮抗作用。

与对照组比较，NP + 大豆异黄酮各剂量组的各项指标均反应出具有生殖危害效应，说明联合作用仍然存在生殖系统的危害，只是比壬基酚单独作用的效应要小。并且随着大豆异黄酮的剂量加大我们可以发现比如平均窝活产只数、活动度、TT活性等都呈现出下降的趋势，表明生殖系统的危害效应呈现增加趋势。当大豆异黄酮剂量达到 450 mg/kg 时，还出现部分指标如平均窝活产只数、活动度、TT活性等指标低于壬基酚单独作用的情况，说明壬基酚和 450 mg/kg 大豆异黄酮对雄性生殖系统的毒性可能表现为相加作用。究其原因，可能是大豆异黄酮同时存在雌激素活性和抗雌激素活性［9］，而大豆异黄酮本身的毒性可能小于壬基酚，二者联合发挥作用时竞争雌激素受体靶位点，低剂量的大豆异黄酮抗雌激素活性发挥作用，拮抗了壬基酚的危害效应；而大豆异黄酮剂量升高时，其自身的危害效应也进一步显现出来。但是其具体的作用机理尚有待于进一步的研究。

本研究中 50 mg/kg 的大豆异黄酮，对NP生殖毒性表现出明显拮抗作用。据资料显示，我国人群的大豆异黄酮的人均摄入量在 15～35 mg/d 之间［10，11］，估计我国居民通过膳食摄入的大豆异黄酮对NP所引起的雄性生殖危害作用可能具有一定的拮抗效应。

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（收稿日期：2006-11-03）

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