贫铀对体外培养成骨细胞的毒性作用

摘要： ［目的］ 研究贫铀（depleted uranium，DU）对体外培养大鼠成骨细胞（osteoblast，OB）的毒性损伤作用，为DU对骨损伤防治提供依据。 ［方法］ 分离并培养原代成骨细胞，分别给予不同浓度（0.001 95 ～0.031 2 mg/ml）的DU溶液，噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖率以观察DU对OB增殖的影响；对硝基苯磷酸二钠盐（PNPP）法测定细胞裂解液中碱性磷酸酶（ALP）活性以观察DU对OB分化能力的影响；矿化结节形成能力和面积测定以观察DU对OB矿化能力的影响。 ［结果］ DU处理组OB增殖率、ALP活性均呈不同程度降低，且随着DU染毒剂量的增加和时间的延长，DU对OB增殖率和ALP活性的抑制作用更加明显，其中0.007 8、0.015 6、0.031 2 mg/ml等染毒剂量组与正常对照组相比，差异有统计学意义（P < 0.01）。此外，DU可明显抑制OB矿化结节形成能力，0.003 9、0.007 8 mg/ml剂量组与对照组相比，差异有统计学意义（P < 0.01 ）。 ［结论］ DU在体外可以抑制OB增殖、分化和矿化能力，对OB的骨形成能力有明显抑制作用。

关键词：贫铀；成骨细胞；增殖；分化；矿化能力

Studies on the Toxic Effects of Depleted Uranium on Osteoblast in VitroXIANG Xi-qiao，ZHU Guo-ying*，WANG Li-hua，YAN Min-fen，CHEN Xiao（Institute of Radiation Medicine，Fudan University，Shanghai 200032，China）

Abstract：［Objective］ To study the acute toxic effects of depleted uranium（DU）on rat osteoblast（OB）in vitro. ［Methods］ Osteoblasts were isolated from rat calvaria and cultured in vitro，then treated with different concentration of DU（0.001 95～0.031 2 mg/ml）respectively. Osteoblast prolifereation was assessed with MTT，alkaline phosphatase activity of osteoblasts was measured with PNPP，and the capacity of mineralization was investigated by counting the area of bone nodules. ［Results］ Compared with control group，the proliferation and the alkaline phosphatase activity of osteoblast were inhibited in DU treatment groups，with significantly lower levels observed in 0.007 8 mg/ml，0.015 6 mg/ml and 0.031 2 mg/ml DU treatment groups（P < 0.01）. With regard to capability of mineration，the area of nodules in osteoblast was significantly lower in 0.003 9 mg/ml and 0.007 8 mg/ml DU treatment groups than control group（P < 0.01）. ［Conclusion］ DU could significantly inhibit the bone formation by inhibiting the proliferation，differentiation and mineralization capability of osteoblast in vitro.

Key Words：depleted uranium；osteoblast；proliferation；differentiation；capability of mineralization

贫铀（depleted uranium，DU），是从天然铀提炼出用于核燃料的235U过程中产生的副产品，就是指235U的丰度低于天然铀中235U 含量（0.711%）的铀。贫铀具有高密度、高熔点和廉价等特点，在军事和民用中应用广泛。DU具有放射性和化学毒性，可通过呼吸道吸入、消化道摄入和从伤口进入人体造成健康危害［1-3］。DU在人体内的主要蓄积器官之一是骨骼，而有关DU对骨骼的毒性作用研究国内外开展甚少。本实验研究DU对体外培养成骨细胞增殖、分化和矿化能力的影响，以探讨DU影响骨代谢的可能机制，为DU的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 24 h内新生SD大鼠，由复旦大学实验动物科学部提供。

1.1.2 主要试剂 DU由核工业部某厂提供。DU片是由99.25%的贫铀和0.75%的钽（tantalum，Ta）组成，其中铀核素的组成：238U占99.75%、235U占0.2%以及痕量的234U（235U/238U值为0.002 94±0.000 05）。DU 溶液的配制：将DU片燃烧灰化，溶于少量浓硝酸，用电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）法精确测量铀质量浓度，临用时以培养液稀释至所需质量浓度。MEM培养基（Gibco），小牛血清（NBS，Gibco），双抗（青霉素，链霉素），Ⅱ型胶原酶（Sigma），胰蛋白酶（Ameresco），噻唑蓝（MTT，Amresco），PNPP（对硝基苯磷酸二钠盐，Fluka），二乙醇胺（DEA），Triton-x 100，SDS，NBT/BCIP染色试剂盒（华美生物工程公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（江苏碧云天生物技术研究所），抗坏血酸，β-甘油磷酸钠，茜素红。

1.1.3 主要仪器 CO2培养箱（Heraeus，德国），酶标仪（Sunrise，澳大利亚），倒置相差显微镜（Olympus，日本），荧光显微镜（Nikon 80i，日本），Pixera 150CL荧光显微数码成像系统（Pixera公司，美国）和Simple PCI专业图象分析系统（Compix公司，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 成骨细胞分离与培养 取24 h内新生SD大鼠头盖骨剪成1 mm×1 mm小块，用0.25%胰酶37℃消化15 min，再用0.1%Ⅱ型胶原酶37℃振荡消化60 min，将含细胞的消化液以1 000 r/min离心5 min，沉淀细胞用含10%NBS的MEM培养液混悬，将细胞悬液接种于培养瓶，置5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养，24 h后换含10% NBS的MEM培养液，以后每3 d换液1次。细胞汇合后传代培养，所用实验细胞均为第2代细胞。

1.2.2 成骨细胞的鉴定 用倒置相差显微镜观察成骨细胞形态，NBT/BCIP染色试剂盒进行细胞ALP染色，显微镜下观察拍照。

1.2.3 DU对成骨细胞增殖的影响（MTT法） 将第2代对数生长期细胞以2.5×103/孔接种于96孔板，每组12复孔。待细胞汇合后染毒。DU染毒剂量分别为0.001 95、0.003 9、0.007 8、0.015 6、0.031 2 mg/ml，对照组加入相同体积的生理盐水（空白对照）或低浓度HNO3（HNO3对照即试剂对照）。继续在5% CO2、37℃的恒温培养箱中培养24、48、72 h后终止培养。测定前4 h，用PBS冲洗后更换无血清MEM培养液100 μl，同时加入10 μl 0.5% MTT，培养箱中孵育4 h，加入150 μl 10% SDS，37℃ 水浴振荡2 h，冷却至室温后在酶标仪上570 nm处测定每孔的吸光度值（D570）。结果与空白对照和HNO3对照比较。

1.2.4 DU对成骨细胞ALP活性的影响（PNPP偶氮法） 细胞接种同增殖率测定。DU染毒剂量分别为0.001 95、0.003 9、0.007 8、0.015 6、0.031 2 mg/ml，对照组加入相同体积的生理盐水（空白对照）或低浓度HNO3（HNO3对照即试剂对照）。继续在5% CO2、37℃的恒温培养箱中培养24、48、72 h后终止培养。弃去培养液，PBS冲洗3次，每孔加入0.05% Triton-x 100 μl超声裂解。取细胞裂解液50 μl于4 ℃预冷的96孔板，再加入150 μl的ALP底物反应液（PNPP-DEA溶液），然后于37℃恒温振荡箱中放置30 min，以NaOH 0.1 mol/L终止反应，酶标仪在405 nm处测定每孔的吸光度D值（D405）。另取4 μl细胞裂解液，按照BCA法蛋白定量检测试剂盒说明进行蛋白定量检测。ALP活性最终以U/mg蛋白表示。结果与空白对照和HNO3对照比较。

1.2.5 DU对成骨细胞矿化能力的影响 将第2代对数生长期细胞以5×104/孔密度接种于24孔培养板，每组4复孔。培养24 h后进行DU染毒，染毒剂量为0.003 9、0.007 8 mg/ml，对照组加入相同体积的生理盐水（空白对照）或低浓度HNO3（HNO3对照）。以后隔天换液，一周后加入矿化诱导液（含50 μg/ml Ascorbic Acid，10 mmol/L Na-β-glycerol-phosphate），第20天用95% 乙醇原位固定30 min，0.2% 茜素红（ARS）进行矿化结节染色并计算面积，以mm2/视野表示。结果与空白对照和HNO3对照比较。

1.3 统计分析

应用SPSS 11.5软件进行统计分析，组间比较采用one-way ANOVA分析，LSD法进行组间两两比较。数据统计结果均用x±s表示，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成骨细胞鉴定

倒置相差显微镜下观察，可见成骨细胞呈贴壁生长，形态为长条形、三角形或多角形，见图1。ALP染色呈阳性反应，胞质呈蓝紫色颗粒，镜下观察分离培养的成骨细胞纯度在85%以上，见图2。

2.2 贫铀对成骨细胞增殖的影响

与对照组比较，不同染毒剂量DU染毒后24 h即均对OB增殖率呈现一定程度抑制，抑制率在0.8%～9.8%之间，但差异无统计学意义（P > 0.05）。染毒后48、72 h，均对OB的增殖有明显抑制作用，且随着染毒剂量的增高、染毒时间的延长，抑制作用增强。其中48 h时间点的OB增殖抑制率达3.8%～21.0%，72 h时间点达15.2%～59.0%。与对照组相比，0.007 8 mg/ml以上剂量DU染毒48 h后、0.001 9 mg/ml以上剂量DU染毒72 h后，对OB增殖率的抑制作用均有显著意义（P < 0.01）。而对于所有时间点，HNO3对照和空白对照比较，细胞增殖率差异均无显著性（P > 0.05）。因此，DU可明显抑制OB的增殖，并与染毒剂量和时间有关，见表1。

2.3 贫铀对ALP活性的影响

不同剂量和时间的DU染毒组细胞ALP活性均较对照组有明显下降。与对照组相比，DU染毒后24 h OB的ALP活性下降5.0% ～ 57.7%，其中0.003 9 mg/ml及以上剂量DU，对OB的ALP活性的抑制作用有显著意义（P < 0.01）。染毒48 h后0.031 2 mg/ml剂量、染毒72 h后0.015 6 mg/ml及以上剂量DU，对OB的ALP活性的抑制作用有显著意义（P < 0.01）。而对于所有时间点，HNO3对照组与空白对照组比较，细胞ALP活性均无明显差异（P > 0.05），见表2。证明DU染毒能明显抑制OB的ALP活性，即DU对OB的分化能力有明显抑制作用。

2.4 贫铀对OB矿化能力的影响

对OB培养20 d后，OB形成肉眼可见的白色矿化结节，经茜素红染色后，可见大小不一、形态各异的红色结节（见图3）。经DU染毒后，OB矿化形成受到明显的抑制。与空白对照组和HNO3对照组相比，0.003 9、0.007 8 mg/ml DU染毒组的矿化结节形成能力呈明显抑制，矿化结节面积明显减小，差异有显著性（P < 0.01）。表明DU对OB矿化能力有明显的抑制作用。见表3和图3。

3 讨论

贫铀进入体内后可以对人体造成各种急、慢性损害，包括对造血、呼吸、消化、泌尿、中枢神经、免疫和生殖系统等均有一定程度的影响［1-3］。美国美军放射生物研究所（AFRRI）的研究结果表明：DU植入后，肾脏、胫骨和颅骨中DU浓度最高，即肾脏和骨骼是DU植入后最主要的蓄积器官［4］。DU长期沉积于骨骼可能导致对骨细胞、骨矿盐结构和骨生物力学性能的直接损伤作用［4-6］。但有关DU对骨细胞的直接损害作用，国内外报道甚少。本实验探讨DU对体外培养大鼠OB增殖、分化和矿化能力的影响，对研究DU致骨代谢损伤的效应及其病理机制，为DU创伤采取的医学处理和预防DU所致远期危害有重要指导意义。

本实验结果表明，DU染毒后24 h，OB增殖率即呈现一定程度抑制；染毒后48、72 h，不同染毒剂量DU均对OB的增殖有明显抑制作用，且随着染毒剂量的增高、时间的延长，DU对OB增殖的抑制作用增强。其中48 h时间点的OB增殖抑制率达3.8% ～ 21.0%，72 h时间点达15.2% ～ 59.0%。可见DU对OB的抑制具有时间效应和剂量效应。OB在骨组织的生长发育、骨代谢平衡中都起着重要作用，OB数量减少或功能受损都会导致骨代谢的异常，影响骨构塑与骨重建，使骨形态和功能受损［7，8］。DU对OB增殖的抑制作用可影响OB的数量，导致骨形成和骨转换异常，引起骨生理紊乱。

OB具有合成和分泌ALP的功能，ALP的表达是OB分化的主要特征之一，ALP活性的高低可反映OB的分化程度，并在新骨形成中发挥着钙结合蛋白的作用［7，8］。本研究结果表明，DU染毒后24 h OB的ALP活性即明显下降，为5.0% ～ 57.7%； 0.031 2 mg/ml 剂量DU染毒48 h后对OB的ALP活性抑制率为34.8%；0.015 6 mg/ml和0.031 2 mg/ml剂量DU染毒72 h后对OB的ALP活性抑制率分别为77.9%和76.1%，表明DU对OB的ALP活性的抑制作用随着DU剂量的加大和作用时间的延长而增加，即呈现明显的剂量效应。因此，贫铀可通过降低OB的ALP活性、抑制OB分化，干扰骨矿化与骨形成过程。

矿化结节形成是OB骨形成功能的形态表现，通过计量矿化结节形成数和矿化结节面积可反应OB的矿化功能。本实验结果表明， DU染毒组矿化结节面积显著减少，表明DU可抑制OB矿化结节的形成，对OB的矿化功能有明显的抑制作用。

已有文献报道［4，9］，贫铀进入体内后的主要蓄积器官是肾脏和骨骼。DU对骨的毒性作用，可能通过对肾脏的间接作用即肾-骨途径，也可能通过对骨的直接毒性作用所致［10］。有关贫铀对骨细胞的直接损害作用，国内外报道甚少［11，12］。本实验结果表明，贫铀对OB具有直接毒性作用，可抑制OB增殖，并能在一定程度上抑制OB的分化及矿化，可能是DU致骨代谢和骨矿盐损伤效应发生的重要机制。

参考文献：

ARFSTEN D P，STILL K R，RITCHIE G D. A review of the effects of uranium and depleted uranium exposure on reproduction and fetal development［J］. Toxicol Ind Health，2001，17（5-10）：180-191.

STORM H H，JORGENSEN H O，KEJS A M，et al. Depleted uranium and cancer in Danish Balkan veterans deployed 1992-2001［J］. Eur J Cancer，2006，42（14）：2355-2358.

张珩，李积胜. 铀对人体影响的机制及防治［J］. 国外医学卫生学分册，2004，31（2）：80-84.

MCCLAIN D E，BENSON K A，DALTON T K，et al. Biological effects of embedded depleted uranium（DU）：summary of Armed Forces Radiobiology Research Institute research［J］. Sci Total Environ，2001，274（1-3）：115-118.

FUKUDA S，IKEDA M，CHIBA M，et al. Clinical diagnostic indicators of renal and bone damage in rats intramuscularly injected with depleted uranium［J］. Radiat Prot Dosimetry，2006，118（3）：307-314.

TISSANDIE E，GUEGUEN Y，LOBACCARO J M，et al. Effects of depleted uranium after short-term exposure on vitamin D metabolism in rat［J］. Arch Toxicol，2006，80（8）：473-480.

COLLIGNON H，DAVICCO M J，BARLET J P. Isolation of cells from ovine fetal long bone and characterization of their osteoblastic activities during in vitro mineralization［J］. Arch Physiol Biochem，1997，105（2）：158-166.

ALBORZI A，MAC K，GLAXKIN C A，et al. Endochondral and intramenbranous fetal bone development：osteoblastic cell proliferation，and expression of alkaline phosphatase，n-twist，and histone H4［J］. J Craniofac Genet Dev Biol，1996，16（2）：94-106.

LEGGETT R W，PELLMAR T C. The biokinetics of uranium migrating from embedded DU fragments［J］. J Environ Radioact，2003，64（2-3）：205-225.

TISSANDIE E，GUEGUEN Y，LOBACCARO J M A，et al. In vivo effects of chronic contamination with depleted uranium on vitamin D3 metabolism in rat［J］. Biochim Biophys Acta，2007，1770（2）：266-272.

MILLER A C，BROOKS K，STEWART M，et al. Genomic instability in human osteoblast cells after exposure to depleted uranium：delayed lethality and micronuclei formation［J］. Environ Radioact，2003，64（2-3）：247-259.

MILLER A C，BROOKS K，STEWART M，et al. Depleted uranium-catalyzed oxidative DNA damage：absence of significant alpha particle decay［J］. J Inorg Biochem，2002，25（1）：246-252.

（收稿日期：2007-01-26）

“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文”。