电针对颈部切口痛及脊髓通路活动影响

本文作者：林丹 阚宇 乔丽娜 王俊英 陈淑萍 韩焱晶 张建梁 刘俊岭 单位：中国中医科学院针灸研究所

脊髓背角是传递外周伤害性刺激等各种信息的初级感觉神经元终末的终止部位，和上传伤害性信息到高位中枢以及高级中枢下行抑制／易化外周伤害性信息的重要驿站，也是痛敏产生和镇痛机制研究的关键部位。谷氨酸是中枢神经系统重要的兴奋性神经递质，参与大脑各种功能。其中，脊髓代谢型谷氨酸受体亚型5（metabotropicglutamaterecep－torsubtype5，mGluR5）和谷氨酸受体亚型1组成的谷氨酸受体家族1亚群参与脊髓痛觉过敏的产生［1－3］。术后痛是急性疼痛的一种表现形式，临床上，针刺能够缓解多种术后痛，减少术后恶心呕吐，改善手术预后［4－5］。动物实验也证明，电针可减轻大鼠足底切口痛行为反应［6－7］。我们过去在颈部炎性痛及神经痛模型大鼠上观察到［8－9］：电针“扶突”等穴区可下调颈部脊髓内Glu、N－甲基－D－天门冬氨酸（NMDA）受体亚型NR2B蛋白以及GluR1mRNA的表达。mGluR5在痛觉过敏机制中发挥关键作用，但是，它是否参与电针缓解颈部切口痛的效应，目前尚未见有报道。因此，本实验在大鼠颈部甲状腺区切口痛的模型上，探讨电针双侧“扶突”穴对动物疼痛反应及脊髓背侧区组织mGluR5基因表达的影响，并观察相应的细胞内信号通路腺苷－3’，5’－环化磷酸（cAMP）／促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）／环腺苷酸应答元件结合蛋白（CREB）的变化，探讨电针缓解术后疼痛的脊髓机制，为临床针刺麻醉行甲状腺手术、缓解术后痛提供实验依据。

1材料与方法

1．1实验动物和分组健康雄性Wistar大鼠40只，体质量250～300g，协和医科大学实验动物研究所提供［健康清洁级，使用许可证号：SCXK（京）2006－0003］，由中国中医科学院针灸研究所动物房（清洁级）喂养。整个实验过程中对动物的各种处理均遵照中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》以及本所2005年《实验室管理条例》中有关动物的使用及伦理学的规定。动物分组：随机分为正常组、模型组、扶突组、合谷－内关组、足三里－阳陵泉组，每组8只。

1．2颈部切口痛模型的制备模型制备前1天，取硫化钡适量，用面粉适量调匀，温水搅成糊状，涂抹在大鼠颈部，脱毛。在异氟烷吸入麻醉下，将动物仰卧，四肢捆绑固定在手术板上，颈部无菌消毒，沿颈中线做长约1．5cm的纵行切口，用眼科钳将胸骨舌骨肌纵向分离开，暴露甲状腺，棉球（生理盐水浸过）轻压止血，然后用5－0缝合线缝合皮肤。操作时为模仿临床甲状腺手术，使用止血钳反复刺激切口深处组织，给予足够的局部刺激。每只动物手术持续10min左右。正常组脱毛麻醉，不做手术切口。

1．3电针治疗按照《实验针灸学》常用实验动物针灸穴位附图中的方法取穴［10］，分别于术后4、24、48h，将大鼠在异氟烷吸入麻醉下仰卧，四肢固定在木板上，根据组别用4支28号13mm长针灸针（苏州针厂产品）分别刺入大鼠双侧“扶突”，同侧“足三里”－“阳陵泉”“合谷”－“内关”穴，连接韩氏电针治疗仪（型号：HANS－100A，联创科技集团南京济生医疗科技有限公司）。电针参数为：疏密波，2Hz／15Hz，前15min1mA，后15min2mA。正常组、模型组相同条件下只麻醉不电针。

1．4痛阈测定各组大鼠用特制布套束缚，分别于术前30min，术后4、24、48h电针前后，用红外线热辐射测痛仪（UGOBASILEtailflickUnit37360），光斑对准颈部切口处进行热辐射痛敏测定。每只测5次，每次相隔5min，计算其平均值。每次以动物明显的躲避行为或轻度嘶叫为准。造模前剔除痛阈测定小于5s或大于30s者（反应过敏或者迟钝）。

1．5荧光定量PCR法检测目的基因的表达量行为学观察结束后，动物深度腹腔注射麻醉（1．5％氯醛糖＋25％乌拉坦混合液，1mL／100g），迅速取脊髓C1～C4段，靠中央管半切，收集靠背角部分的组织，－70℃下储存备用。用超纯RNA提取试剂盒（CWbio．Co．Ltd，Cat＃CW0581）提取组织样本中总RNA。用RNA电泳证实RNA未降解，测定所抽提RNA浓度。用HiFi－MMLVcDNA第一链合成试剂盒（CWbio．Co．Ltd，Cat＃CW0744）进行反转录。用Ultra－SYBRMixture（withRox，CWbio．Co．Ltd，Cat＃CW0956）进行PCR反应，引物序列［11］见表1。反应体系为10μL。反应扩增条件为：95℃变性10min，95℃15s，60℃1min，共40个循环。获得mGluR5mRNA、cAMPmRNA、MAPKmRNA、CREBmRNA与β－actin的Ct值，参照文献［12］的方法，以目的基因相对于基础值的表达量，即2－Ct［－Ct＝－（Ct－Ct基础值），Ct＝Ct目的基因－Ctβ－actin］反映各检测指标的表达水平。1．6统计学分析所有数据以均数±标准差（x珚±s）表示。用SPSS11．5统计软件进行数据处理，组间差异比较用单因素方差分析，各组间均数的两两比较采用LSD检验，组内比较采用配对t检验，P＜0．05表示差异有统计学意义。

2结果

2．1电针对切口痛大鼠痛阈变化的影响与正常组比较，甲状腺区切口术后，模型组动物的躲避潜伏期明显缩短，即痛阈值明显降低（P＜0．05，图1）。与模型组比，电针扶突、合谷－内关组动物的痛阈明显升高（P＜0．05）；而电针足三里－阳陵泉组的痛阈值未见明显变化（P＞0．05）。

2．2电针对大鼠脊髓mGluR5mRNA表达的影响见图2。与正常组比较，颈部切口术后，模型组动物脊髓mGluR5mRNA表达量显著增高（P＜0．05）。与模型组比较，电针扶突组mGluR5mRNA的表达量轻度降低（P＞0．05），但是比电针足三里－阳陵泉、合谷－内关组作用明显（P＜0．05）；电针足三里－阳陵泉、合谷－内关组脊髓mGluR5mRNA的表达量变化不大（P＞0．05）。

2．3电针对脊髓颈段背角细胞内cAMP／MAPK／CREB信号通路活动的影响

2．3．1电针对颈髓背角cAMPmRNA表达的影响与正常组比，模型组脊髓背角cAMPmRNA表达量明显上调（P＜0．05）；与模型组比，电针扶突组的表达量显著降低（P＜0．05，图3），而电针合谷－内关组及足三里－阳陵泉组cAMPmRNA的表达无明显变化（均P＞0．05）。

2．3．2电针对颈髓背角MAPKmRNA表达的影响与正常组比，模型组脊髓背角MAPKmRNA表达量增多，但差异无统计学意义（P＞0．05）；与模2．3．3电针对颈髓背角CREBmRNA表达的影响与正常组比较，模型组脊髓背角CREBmRNA表达量显著增多（P＜0．05，图5）；与模型组比，电针扶突组CREBmRNA表达水平明显下降（P＜0．05），而电针合谷－内关、足三里－阳陵泉组无明显变化（P＞0．05）。

3讨论

谷氨酸是机体神经系统中最为重要的兴奋性神经递质，参与包括伤害性信息在内的各种信息的传递。其受体可分为离子型（iGluRs）和代谢型（mGluRs）。iGluRs包括NMDA、红藻氨酸盐酸及α－氨基羟甲基恶唑丙酸受体亚群，而mGluRs又可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3组受体亚群8种亚单位［13］。mGluR5属于mGluRs的第1组，参与脊髓背角神经元－胶质细胞疼痛信息等信号交流，在痛觉过敏产生中发挥关键作用［3，14］。本实验结果表明，颈部切口手术以后，动物创口局部痛阈明显减低，电针“扶突”穴、“合谷”－“内关”穴后其痛阈明显增加，而电针“足三里”－“阳陵泉”的效应不明显。这些与我们过去在颈部炎性痛和切口痛模型的实验结果［8，15－16］基本相同。此外，切口术后脊髓C1～C4段mGluR5mRNA、cAMPmRNA、CREBmRNA的表达显著升高，MAPKmRNA的表达量也有一定程度的升高；电针“扶突”穴区后，脊髓cAMPmRNA及CREBmRNA表达量显著降低，mGluR5mRNA的表达也呈下调趋势。提示，电针“扶突”穴的镇痛效应与其下调脊髓C1～C4段cAMPmRNA、CREBmRNA及mGluR5mRNA的表达密切相关。外周手术等创伤产生的伤害性信息由Aδ和C类初级感觉神经纤维传入，通过脊髓背角上行投射性神经元传递到高位中枢，进而产生痛觉。Glu是主要的兴奋性神经递质，和P物质（SP）在脊髓后角的初级神经终末共存［17］，参与痛觉信息的传递与痛觉的维持［18－19］。mGluR5在脊髓后角的分布与此处的Glu阳性纤维的分布一致，因此，mGluR5也是脊髓后角痛觉信息的传递和疼痛敏化加工的基质之一［20］。有报道电针镇痛时，可明显下调SP，和Glu、NMDA受体的表达［21－22］。细胞内cAMP可引起感觉神经细胞的过度兴奋和痛觉过敏，减少痛觉感觉神经细胞产生cAMP可提高机体对痛觉的耐受性，减少痛觉敏感化及痛觉信号的上传，从而起到镇痛作用。针刺镇痛过程中，不同脑区cAMP和cGMP（环磷酸鸟苷）的含量可得到相应的调节［23］。MAPK级联信号通路是介导细胞反应的重要信号系统，是细胞外信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递途径。CREB是细胞内激酶的底物，许多信号途径都可以通过不同的激酶激活CREB使其磷酸化，调节许多产物的表达，其中很多与疼痛中枢敏感化的形成关系密切［24－25］。足底切口痛可上调脊髓背角CREB和p－CREB［26］。还有报道［27］，关节炎痛大鼠同侧腰段脊髓背角NMDAR亚单位NR2B蛋白、胞外调节激酶（ERK）、CREB发生磷酸化，电针“足三里”－“三阴交”和NMDAR拮抗剂联合应用（鞘膜内给药）产生协同镇痛效应的同时，可抑制脊髓NMDARNR2B亚单位和ERK的磷酸化；电针还可抑制脊髓p38MAPK的表达，但对CREB的变化未见明显影响。上述结果大体上与我们的结果一致。总之，本实验研究表明，电针“扶突”可显著升高颈部切口痛大鼠术后痛阈，该作用与其下调C1～C4段脊髓mGluR5、cAMP、CREB基因表达水平密不可分。