脑缺血对皮层蛋白的影响

本文作者：王占奎 张连城 赵淑华 张津玮 尚立华 张玉莲 林翠茹 郭家奎 单位：天津中医药大学第二附属医院针灸脑病中心

蛋白激酶C（PKC）是一种依赖磷脂和钙的蛋白激酶，由多种具有不同生物学特性的同工酶组成。在脑中至少已发现有7种同工酶的存在，而PKCγ为脑和脊髓所独有，PKCδ在脑组织中含量非常丰富［1］。PKC是细胞信号转导途径中的重要物质，在脑缺血再灌注过程中，由于血液供应中断而发生一系列细胞内代谢的异常，引起胞内信号级联放大效应从而产生大量有害因子，使缺血性梗死面积扩大，导致神经细胞大量死亡。有研究表明，PKCγ、PKCδ的异常表达在脑缺血再灌注病理机制中扮演重要角色［2－3］。随着特异PKC抑制剂和激活剂的出现，人们对PKCγ、PKCδ在脑缺血再灌注中的作用机制将会有更深入的认识，这也为临床治疗脑卒中提供新的靶向治疗剂［4－5］。目前靶向治疗多是针对脑卒中的某一环节而设，但临床使用抑制剂和激活剂存在着明显的副作用和药代学问题。有些抑制剂和激活剂不能穿透血脑屏障，也使此类药物的应用受到限制。尤其是，药物刺激的能力及稳定性能否使受损的神经细胞在病灶局部达到功能性整合，可能是今后相当长时间内需要解决的难题。近年来学者们开展了针刺对神经保护作用机制方面的研究，结果不仅证实了针刺疗法的有效性，更为针刺疗法的运用提供了科学依据［6－7］。陆汎等研究［8］表明，电针治疗能有效地逆转大鼠海马PKC的阳性表达而改善行为学症状，其机制可能是通过调节海马细胞信号转导通路相关酶的功能而实现的。“调神通络”针法多年来治疗中风均取得较好疗效［9］。临床研究表明，“调神通络”针法治疗脑梗死疗效明确，其主要机制是通过改善全身状况，调节大脑血液循环，增加脑血流量，加快侧支循环的建立，从而促进脑神经细胞的修复［10］。因此，我们以“调神通络”针法为干预手段，以PKCγ、PKCδ为切入点，探讨脑缺血神经损害的部分机制及针刺的干预作用机制。

1材料与方法

1．1动物及分组雄性健康Wistar大鼠，由军事医学科学院第四研究所实验动物中心提供，许可证号：SCXK－（军）2002－001，体质量（250±30）g。随机分为针刺组、模型组、正常组。前两组内分设4个亚组：缺血再灌注4、12、24、72h组，每组8只大鼠。

1．2主要试剂及仪器PKCγ、PKCδ抗体（山羊抗鼠／兔IgG，1∶200，美国Sigma），二抗为生物素化兔抗山羊IgG（1∶500，ABCKit），TUNEL试剂盒（德国Boe－hringerManmheim公司），DAB显色试剂盒（Sigma进口分装）；北航CM－2000B医学图像分析系统，冰冻切片机（HB7T－B－4，西化仪科技有限公司）。

1．3造模方法参照Longa［11］线栓法并加以改进。除正常组外所有大鼠术前1d禁食不禁水。用10％水合氯醛（350mg／kg）腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定。颈部正中切开皮肤，钝性分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，仔细分离避免损伤迷走神经。由颈总动脉分叉处结扎颈外动脉，用微型动脉夹夹住右侧颈总动脉近心端及远心端，在靠近颈总动脉分叉处用1mL注射器针头扎一小眼，将直径0．26mm的尼龙钓丝涂有石蜡的一端沿小眼插入右侧颈总动脉，移去颈总动脉远心端的动脉夹，经颈总动脉分叉处钓丝缓慢向颈内动脉入颅脑内的方向推进约17～18mm，遇阻力时停止，使钓丝头端到达较细的大脑中动脉起始处。缚紧预先放置于穿刺小眼处的丝线，缝合，消毒，于右侧脑缺血1h后拔出栓线，建立缺血再灌注模型。实验操作过程中对大鼠的处置符合科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。造模完成后按Zausinger6分法［12］来评价模型成功与否，去除评分为0分及4分和5分的动物。0分：不能自发行走；1分：自由走动状态下向病变对侧旋转；2分：抓住鼠尾，大鼠向病变对侧旋转；3分：对于施向病变对侧的侧压力抵抗力下降；4分：不能伸直病变对侧前爪；5分：无神经功能缺损。

1．4针刺方法选取右侧“顶中线”（“百会”至“前顶”）、“顶旁线”（相当于国标顶旁2线，“承灵”与“正营”连线）作为针刺穴位，参照《大鼠穴位图谱的研制》［13］确定位置。在造模成功后，用自制布袋将大鼠固定于实验台上，用0．25mm×25mm毫针沿皮刺入穴位，进针15mm。然后连接长城KWD－8082电针仪刺激10min，频率为2Hz／15Hz的疏密波，电流强度约1mA，强度以肢体轻微抖动为宜。4、12h针刺组在再灌注后针刺1次，24、72h针刺组在再灌注后每隔12h针刺1次。正常组和模型组同样抓取，不作其它处理。

1．5观察指标及检测方法各组大鼠达到缺血再灌注时限后，经左心室灌注磷酸盐缓冲液（PBS，pH：7．25～7．35）250mL和4℃4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PFA）250mL，进行心脏灌注内固定，断头取脑，在冰冷的自制脑膜上，用锋利的刀片连续冠状切开脑组织，切开的组织块含有大脑皮层，切成200μm厚的脑片，置于4％PFA中，4℃后固定4h，再移入30％蔗糖PBS溶液浸泡24h，－80℃冰箱冻存待用。PKC同工酶的检测用SABC免疫组化染色，具体步骤如下：（1）切片常规脱蜡、脱水；（2）PBS洗2次各5min；（3）用PBS配制新鲜的3％H2O2，室温封闭5～10min，用蒸馏水洗3次；（4）抗原修复；（5）PBS洗5min；（6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20min，甩去多余液体；（7）滴加一抗50μL，室温静置1h或4℃过夜或37℃1h；（8）PBS洗3次各2min；（9）滴加生物素化二抗，20～37℃20min；（10）PBS洗3次各2min；（11）滴加试剂SABC20～30℃20min；（12）PBS洗4次各5min；（13）DAB试剂盒显色剂显色；（14）终止后常规脱水、透明、封片。光镜下观察、照相和记录，于计算机下测定吸光度值，取其平均值（5个视野取均值）。神经元凋亡的原位观察采用荧光标记的终末去氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）。神经元凋亡染色采用缓冲亚甲蓝法尼氏染色。应用北航CM－2000B医学图像分析系统进行分析，400倍光学显微镜下计数缺血侧大脑皮层阳性神经元细胞数。1．6统计学方法采用SPSS12．0医学统计软件处理，数据以均数±标准差（x珚±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0．05表示差异有统计学意义。

2结果

（见图1、图2、图3）PKCγ、PKCδ阳性细胞呈棕褐色，蛋白呈胞质、胞膜表达。模型组与正常组比较，缺血1h再灌注4h，PKCγ阳性表达开始增加，再灌注24h达高峰（P＜0．01），72h开始减少；在缺血1h再灌注4h，PKCδ蛋白表达升高，再灌注24h、72h仍保持较高的水平。凋亡细胞染色质浓集于核周、呈新月形、环形、长条形、块状小体等形态，表现为细胞体缩小，变成三角形，尼氏小体溶解、消失，胞质呈均匀蓝色，胞核浓缩深染，结构消失。针刺组各时间点PKCγ、PKCδ阳性表达相对增幅缓慢，峰值减低，凋亡细胞数都较模型组明显减少（P＜0．05，P＜0．01），说明针刺能明显抑制PKCγ、PKCδ阳性蛋白表达，减轻缺血性脑损害。

3讨论

在缺血性脑损害过程中，由于血液供应中断而发生一系列的细胞内代谢异常，最终导致神经元变性甚至死亡。这个过程中可能有多种PKC同工酶参与，PKC的活性和表达的改变与缺血再灌注过程紧密相关。PKCγ在细胞增殖、分化、神经递质的运输、释放及肿瘤发生等方面起着重要作用，尤其在中枢神经系统介导缺血损伤过程中发挥重要的作用［4］。缺血再灌注引起PKCγ表达增加可能原因是：（1）钙离子（Ca2＋）是PKC激活的必然介质；（2）缺血再灌注后的病理变化之一是细胞内Ca2＋增加。增加的Ca2＋刺激PKC的膜转位，使膜含量增加，这是一种细胞抗伤害保护性的反应［14－16］。PKCδ是新型PKC（nPKC）家族成员，广泛存在于脑组织细胞中。与传统型PKC（cPKC）和非经典型PKC（aP－KC）不同的是，PKCδ能被非Ca2＋依赖性激活。激活后的PKCδ是凋亡信号的重要介导者。PKCγ与N－甲基－D－天冬氨酸（NMDA）受体磷酸化有关，PKCγ的激活，促使兴奋毒性氨基酸释放增加，从而加重缺血性神经元毒性损害，引起神经元坏死或凋亡［17］。脑缺血再灌注过程中，胞内信号级联放大效应导致产生大量有害因子，使缺血性梗死面积扩大，细胞死亡。PKCγ、PKCδ介导了氧化应激、凋亡、炎性反应，是再灌注损伤的重要介质，在脑缺血再灌注中发挥重要的作用［4，18］。对于一些能够封闭PKC活性及阻断细胞因子与受体结合，或干扰信号转导通路的PKC抑制剂就有可能干预PKC的激活而成为脑保护剂。因而，PKC的抑制剂对神经元的保护作用越来越被人们重视。针刺治疗中风历史悠久，其有效性和科学性也已被证实。随着现代生物学和信息学的发展，我们在研究过程中，可尝试给脑血管病信号分子赋予有中医特色的微观意义，使这些微观指标与传统中医结合起来，在微观层次上建立特有的针灸理论及临床方法［19］。以针刺理论为指导的动物实验业已证实针刺可减轻脑缺血损伤后病理损害程度。针刺脑缺血再灌注大鼠“水沟”“百会”，可明显减轻大鼠脑缺血再灌注损伤，上调神经细胞线粒体膜电位水平，抑制细胞的凋亡率［20］。针刺也可明显减轻线粒体超微结构的病理变化［21］。PKC同工酶在脑缺血再灌注中扮演着重要角色，其功能和活性可以被PKC抑制剂所阻断。我们观察到脑缺血再灌注后PKCγ、PKCδ均在大鼠脑内异常表达，主要见于缺血侧海马、皮质及纹状体等部位，因而可以推测PKC同工酶参与了缺血后的迟发性损害和远隔部位缺血性损害。在实验中观察到针刺能明显减少PKCγ、PKCδ蛋白表达及神经元凋亡。这和其他学者的研究结果一致［22］。神经元凋亡数目的减少与其梗死体积的缩小呈正相关，因此我们认为“调神通络”针法具有脑保护作用，它可作为PKC的非特异性抑制剂，通过抑制PKCγ、PKCδ蛋白表达，进而抑制NMDA受体通道的磷酸化，减少兴奋毒性氨基酸的释放，使神经元凋亡或坏死细胞数目减少，避免缺血性脑损害的加重。同时针刺可通过多靶点作用抑制PKC激活，减轻脑血管痉挛，增加缺血局部脑血流量，改善脑微循环，减少细胞凋亡，使脑损伤减轻，从而对脑缺血神经元起着保护作用。脑缺血再灌注损伤是极为复杂的病理生理反应，是由多种因素参与的连锁过程。本研究在临床疗效基础上从对PKC同工酶影响方面来探索“调神通络”针法的作用机制，充分发挥针刺的优势，在有效“时间窗”内采取多靶点、多水平、多通道的干预措施，对急性脑梗死的转归至关重要，这也是我们今后研究的重点。至于针刺参与阻断脑缺血再灌注损害神经元凋亡的发生发展以及其对下调PKC同工酶表达方面的具体机制还有待于进一步研究。