运动营养补剂对尾部悬吊大鼠比目鱼肌梭内、外肌纤维mATP酶活性的影响

摘 要：目的：研究服用冬虫夏草对尾部悬吊大鼠比目鱼肌湿重及梭内、外肌纤维mATP酶活性的影响，旨在探讨在废用条件下冬虫夏草对梭内、外肌代谢的改变。方法：采用尾部悬吊法建立废用性肌肉萎缩模型，以钙增强的mATPase法检测废用条件下大鼠比目鱼肌梭内、外肌的mATP酶活性变化。结果：尾部悬吊可使梭外肌Ⅰ型肌纤维的构成比减少，Ⅱ型肌纤维的构成比增加，梭内肌纤维mATP酶活性增强，核袋1纤维mATP酶染色不变或由阴性转变为弱阳性，核袋2纤维和核链纤维由阳性转变为强阳性。服药组梭内、外肌mATP酶活性变化显著低于吊尾对照组(P＜0．05)，比目鱼肌湿重显著高于吊尾对照组(P＜0．05)。结论：服用冬虫夏草对尾部悬吊大鼠比目鱼肌梭内、外肌纤维类型转化有明显的对抗作用。

关键词：尾部悬吊；肌梭；mATP酶；冬虫夏草

冬虫夏草作为一种药用真菌，其生物学特性及化学成分已经阐明，药用范围也十分广泛，但对废用性肌肉萎缩的影响及其与梭内肌纤维的变化关系，尚未见相关报道。为此，本研究以大鼠尾部悬吊法模拟废用，观察冬虫夏草对尾部悬吊大鼠比目鱼肌梭内、外肌纤维mATP酶活性的影响，旨在探讨冬虫夏草对废用条件下梭内、外肌代谢的影响，为冬虫夏草对废用性肌肉萎缩的防治效果及机制研究提供实验资料。

1　材料与方法

1．1 药物制备 冬虫夏草(CS)购自西安市药材总公司。批亏：020312。将原药烘干磨碎，取干粉10g，加蒸馏水100mL，置56℃水浴箱1 h，悬液经2 000r／min离心15min，取上清液经0．45μm混合纤维素酯膜滤器过滤除菌，提取物pH为6．4，得到浓度为100mg／mL(按原生药计)样品液，置4℃冰箱存放备用。 1．2 动物分组 选用健康活泼雌性Sprague―Dawley大鼠24只，体重200～250g，按随机配对原则随机分为3组：正常对照组(CON)、14d吊尾(SUS)对照组及14d吊尾服药组(SUS+踢)，每组各8只动物。

1．3 废用模型的建立 采用陈杰改良式大鼠尾部悬吊法建立废用性肌肉萎缩模型。大鼠单笼饲养，尾部悬吊，前肢着地，后肢悬空，身体长轴与水平面呈30°角，在笼内可自由活动、进食饮水。室温保持在，20～25℃，12h循环光照。服药组灌服冬虫夏草提取液1．5mL／d，对照组灌服生理盐水1．5mL／d。

1．4 标本制备 戊巴比妥钠(45mg／kg)腹腔注射麻醉动物，迅速取出右侧比目鱼肌称重，切除两端肌腱，选取肌腹中段处约10mm的组织块，投入预冷的300g／L蔗糖溶液中至完全沉底。在-20℃恒冷箱中用OCT包埋剂垂直包埋组织块，低温恒冷切片机切片，切片厚度10μm。调整组织块方向以获得肌肉横断面组织切片。用涂有10g／L铬钒明胶的载玻片裱片，室温晾干。

1.5 组织化学染色 切片经20mL／L戊二醛-40g／L多聚甲醛固定约10min，充分洗于冷双蒸水，入预孵液(0．1 mol／L巴比妥钠2mL，0．18naol／L－1CaCl22mL，双蒸水6mL，调至pH9．4)15min，然后人孵育液(ATP二钠盐30mg，2，4―二硝基酚6mS，0．1mol／L巴比妥钠2mL,0．18mol／LCaCl21 mL，双蒸水7mL调至pH9．4)1h,209／LCaCl2浸洗三次，换至20g／L氯化钴液5min，充分双蒸水洗，入1％硫化铵2min，水洗、脱水、透明、封固。

1.6 数据采集与统计分析 对各组动物比目鱼肌组织随机抽取一张接近肌腹中部的组织切片，根据mATP酶活性强弱对肌纤维进行分类，KONTRONIBAS2．5全自动图像分析系统(德国)对切片内所有肌纤维按类别进行标记，然后分类统计，组内同类肌纤维合计，并计算各类肌纤维占组内纤维总数的构成比。所有实验数据均以均数±标准误(x±sx)表示，各组间的差异采用方差分析，以P＜0．05作为显著性差异的界值。观察梭内肌纤维的mATP酶活性，作定性描述。

2 结 果

2．1 比目鱼肌湿重及梭外肌纤维构成比 服药组比目鱼肌湿重显著高于吊尾对照组(P＜0．05)。在pH9．4的条件下，Ⅰ型肌纤维mATP酶染色呈阴性，Ⅱ型肌纤维则呈强阳性，染为棕黑色。正常对用组82．69％的肌纤维mATP酶染色呈阴性，表明比目鱼肌是以Ⅰ型肌纤维为主的慢肌(图1)。尾部悬吊14d后，大鼠比目鱼肌肌纤维构成比有明显改变，Ⅰ型肌纤维的构成比显著减少(P＜0．05)，Ⅱ型肌纤维的构成比显著增加(P＜0．05)(图2)，而服药组肌纤维类型的转化程度低于较吊尾对照组(P＜0．05)(图3)(表1)。

2．2 比目鱼肌梭内肌纤维mATP酶活性 正常对照组肌梭核袋1纤维mATP酶染色呈阴性(―)，核袋2纤维及核链纤维则呈阻性(+)表达(图4)，悬吊14d后各纤维mATP酶活性均有增加，核袋1纤维呈阴性(－)或弱阳性(+)，核袋2纤维及核链纤维则呈强阳性(++)(图5)。服药组梭内肌纤维mATP酶活性的反应改变均不明显(图6)。

2．3 mATP染色的特异性 所设mATP染色替代对照实验结果为阴性。

3 讨 论

骨骼肌根据其外观色泽和收缩特性可分为红肌(慢肌)和白肌(快肌)，这是以肌细胞(肌纤维)的异质性为基础的。根据形态学特征、代谢酶类型以及所含肌球蛋白类型的不同，骨骼肌纤维可分为Ⅰ型和Ⅱ型两大类，其中Ⅱ型又可分为Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc三型。工型肌纤维较细小，肌浆内肌红蛋白和细胞色素含量多，能量代谢方式为有氧氧化。Ⅱ型肌纤维较粗大，肌红蛋白和细胞色素含量少，能量代谢方式以糖酵解为主，其中Ⅱa型肌纤维既能进行糖酵解，又能进行有氧氧化，为氧化和酵解代谢的双重型。

肌梭是骨骼肌内的一种重要的牵张感受器，由核袋纤维和核链纤维构成。核袋纤维根据其组织化学、超微结构和机械特性的不同，又可区分为核袋1纤维(动力性核袋纤维)和核袋2纤维(静力性核袋纤维)。核袋1纤维的代谢特点类似慢肌，而核袋2纤维和核链纤维则类似快肌。

mATP酶(pH9．4)可作为糖酵解的标志酶，在pH9．4的条件下，I型肌纤维mATP酶染色呈阴性，Ⅱ型肌纤维则呈强阳性。梭内肌纤维中核袋1纤维呈阴性，其他纤维则呈阳性。本研究结果表明，尾部悬吊14d后，梭外肌Ⅰ型肌纤维的构成比明显减少，Ⅱ型肌纤维的构成比明显增加(P＜0.05)，提示废用条件下梭外肌纤维的代谢特点发生了明显的改变，与废用所致肌肉萎缩密切相关。尾部悬吊14d后，梭内肌纤维的mATP酶染色特性也发生了改变，各纤维mATP酶活性均有增加，表明梭内肌纤维的代谢特点也发生了明显的改变。

现代药理及临床研究证明，冬虫夏草对免疫及血液系统的调节、对内脏损伤的保护防治以及抗衰老、抗应激作用均有很好的药理活性，其主要药效成分有氨基酸、麦角醇、粘多糖、D－甘露醇、尿嘧啶、腺嘌呤、次黄嘌呤和虫草素。本研究结果表明，服用冬虫夏草提取液后，大鼠比目鱼肌湿重显著高于吊尾对照组(P＜0．05)，肌纤维类型的转化程度显著低于吊尾对照组(P＜0．05)，肌梭内肌纤维mATP酶活性的转化程度低于吊尾对照组，提示服用冬虫夏草对废用性肌肉萎缩有对抗作用，其可能机制为：1)废用可引起大鼠心血管系统发生结构与功能的适应性变化。冬虫夏草中氨基酸及微量元素可以通过提高多种酶的活性，减少红细胞压积、改善红细胞变形能力，从而提高红细胞的质量，调节血液粘度；所含腺苷类物质对心血管系统具有增加心输出血量和冠状脉血流量作用，可以减缓肌肉废用后泵血功能的衰退。2)废用可引起机体免疫系统发生衰退。冬虫夏草中D－甘露醇和多糖类物质是免疫增强和调节剂，它可激活机体的免疫活性细胞，尤其是T淋巴细胞及其淋巴因子、单核－巨噬细胞系统等，从而改善梭内外肌纤维的代谢环境，对抗废用性肌肉萎缩的产生与发展。3)废用可引起骨骼肌线粒体钙超载，而细胞内钙稳态、钙转运功能改变，必然影响肌肉收缩特性。冬虫夏草中虫草素或其代谢产物可以通过促使Ca2+泵和Na+-Ca2+交换体的活动增强，降低肌细胞内Ca2+浓度，减轻肌细胞钙超载。虫草素还可能对肌梭有兴奋作用，使肌梭的[Ca2+i产生变化，从而使其传人放电明显增加，改善梭内、外肌的代谢环境。

本文在国内首次报道了冬虫夏草对废用致比目鱼肌湿重降低、肌纤维类型转化、梭内肌纤维变化均有一定对抗作用的研究结果，这对冬虫夏草在康复医学以及运动医学中的广泛应用提供了理论依据和实验事实，关于用药剂量、服药时间与抗肌萎缩效果之间的关系以及影响机制，有待于进一步的研究。