黄花乌头中盐酸关附甲素的提取工艺研究

摘要：为了更好地利用黄花乌头（Aconitum coreanum）资源，提高其产品附加值，以黄花乌头中盐酸关附甲素的提取量为指标， 通过设立正交试验确定影响提取率的主要因素以及最佳提取条件。结果表明，最佳的热回流法提取工艺条件为： 提取溶剂为50%乙醇，提取温度为80 ℃，料液比为1∶20，提取时间为40min。此提取工艺简单可行、稳定可靠，适用于盐酸关附甲素的大规模提取。

关键词：黄花乌头（Aconitum coreanum）；盐酸关附甲素； 提取工艺； 高效液相色谱法； 热回流法； 正交试验

中图分类号：Q949.746.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）18-4479-02

黄花乌头（Aconitum coreanum）[1]，又名关白附、白附子、竹节白附、黄乌拉花[2]，为毛茛科乌头属植物，为中医临床常用中药之一。从20世纪末到21世纪初，各国的科学工作者一直致力于黄花乌头中活性成分的提取、分离、纯化的研究[3]。根据文献我们可以了解到，很多现代化的研究方法被应用到了黄花乌头盐酸关附甲素的提取中，这些方法的研究让很多人眼前一亮，看到了成分提取行业发展的新方向。同时，这也让越来越多的人关注并且加入到这方面的研究中来[4-6]。随着研究的不断深入，也暴露出一些原本就存在的问题，例如对外界环境的污染、成本投入过高等实际问题。由于方法本身的问题、局限性以及现阶段科学技术水平的限制，使得这些方法在短时间内无法应用于实际生产中，不能转化为经济效益。而传统意义上的提取方法似乎并未受到人们的关注，很少有这方面的研究成果报道。加热回流提取法相对于其他的提取方法具有成本低、污染小、可控性强、提取率稳定等优点，又是生产中常采用的方法。本试验采用了传统的加热回流提取法对黄花乌头中盐酸关附甲素的提取条件进行研究，采用药典中规定的高效液相色谱法[7]对其含量进行测定，而不是采取以往的分光光度法，并通过单因素试验和正交试验寻找影响提取率的主要因素和最佳条件，希望能够为实际生产提供一些理论依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验样品

黄花乌头干根，2011年9月采于吉林农业科技学院中药学院药用植物园。

1.2 试验仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪、SPD-20A型紫外检测器（岛津公司）；HH-S4型恒温水浴锅（购于金坛市医疗仪器厂）；LG-08A型装高速中药粉碎机（400g）（购于深圳市百源堂医疗器械有限公司）；XL-204型电子天平（梅特勒-托利多）。

1.3 药品与试剂

盐酸关附甲素对照品，购于江西本草天工科技有限责任公司；其他试剂均为分析纯。

1.4 盐酸关附甲素的提取

将新鲜的黄花乌头用清水洗净，阴干，粉碎，过60目筛，备用。精确称取10.0 g黄花乌头粉末，用20 mL氨水润湿30 min，然后将粉末倒入磨口锥形瓶中，加入乙醇，置于水浴中回流提取。提取完成后将锥形瓶取出，放置冷却至室温，然后过滤，得到滤液。滤液抽滤，减压浓缩，再加入HCl酸化，过滤，滤液加50 mL石油醚脱脂，加氨水碱化，调节pH至9～10，加入100 mL氯仿，萃取，取氯仿层至25 mL容量瓶中，干燥，用甲醇定容至刻度，摇匀，备用。

1.5 试验设计

设计了4因素3水平正交试验，考察了提取温度（A）、料液比（B）、乙醇浓度（C）以及提取时间（D）对黄花乌头中盐酸关附甲素提取的影响作用并得出最佳工艺条件。

1.6 盐酸关附甲素的测定方法

采用高效液相色谱法测定盐酸关附甲素含量，色谱条件为：色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为1%甲酸-乙腈溶液，流速为1 mL/min；检测波长为205 nm；柱温30 ℃；检测时间25 min；进样量20 μL。

盐酸关附甲素提取率=盐酸关附甲素浓度×25/药粉干重×1 000‰

2 结果与分析

2.1 对照品溶液的制备及标准曲线的制作

精密称取盐酸关附甲素对照品10 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成含盐酸关附甲素1 000 μg/mL的标准储备液。

吸取标准储备液2.5、5.0、10.0 mL分别置于3个10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。配制成盐酸关附甲素浓度分别为250、500、1 000 μg/mL的标准溶液。

用高效液相色谱仪对3个不同浓度的标准溶液进行测定。然后以盐酸关附甲素标准浓度为纵坐标，以峰面积为横坐标，制作标准曲线并得到线性回归方程。盐酸关附甲素进样量在250～1 000 μg/mL范围内有较好的线性，方程为y=2 177.509x+1 673 485，r=0.989 2。

2.2 精密度试验

用配置好的盐酸关附甲素标准样品，重复测试5次，并计算其峰面积的相对标准偏差（RSD）。结果经过测定，盐酸关附甲素峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.24%，表明高效液相色谱仪精密度良好，可以进行相关试验的测定。

2.3 重复性试验

取同一批次黄花乌头用相同条件提取5份，对其盐酸关附甲素含量进行测定，并计算其峰面积的相对标准偏差（RSD）。结果提取5份黄花乌头盐酸关附甲素，其峰面积的相对标准偏差（RSD）为1.28%，表明试验具有很好的重复性。

2.4 数据分析

由表2可知，各个因素对黄花乌头中盐酸关附甲素提取的影响顺序为A>B>D>C，即，提取温度>料液比> 提取时间>乙醇浓度。最佳搭配为A2B2D2C1，最优的提取条件为A2B2C1D2，即，提取温度为80 ℃、料液比为1∶20、乙醇浓度50%、提取时间40 min。

3 小结与讨论

本试验采用传统的热回流提取法并利用高效液相色谱法对黄花乌头中盐酸关附甲素提取工艺进行了研究，得出结论：提取温度为80 ℃、料液比为1∶20、乙醇浓度50%、提取时间40 min为黄花乌头中盐酸关附甲素热回流提取的最佳条件，其中提取温度对提取率的影响最大，其次是料液比和提取时间，乙醇浓度的影响作用最小。

本试验采用了传统的热回流提取法，与其他提取工艺相比，此方法简单易行、污染小、成本低，广泛应用于生产实践中。本试验采用高效液相色谱法进行含量测定，相对于以往的分光光度法更灵敏、准确。相关文献大都采用分光光度法测定盐酸关附甲素含量，此种方法虽然可行但误差很大。采用高效液相色谱法测定盐酸关附甲素的含量，准确度大大提高，结果更可信。

参考文献：

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1979.

[2] 国家中医药管理局《中华本草》编辑委员会.中华本草（上册）[M].上海：上海科学技术出版社，1996.

[3] 李 岩，梁 帅.黄花乌头茎叶化学成分的研究[J].中国中药杂志，2009，34（10）：1220-1222.

[4] 毛淑杰，李先端，程丽萍，等. 关白附新工艺最佳技术参数优选[J].中国中药杂志，1997，22（10）：595.

[5] 许勇华. 川乌中生物碱的提取及其杀虫活性研究[D].武汉：华中农业大学，2007.

[6] 周 琳.植物生物碱的杀虫作用及应用[J].河南林业科技，2007，27（1）：32-36.

[7] 冯 锋，黄 剑，刘静涵.RP-HPLC法测定不同采收期黄花乌头中关附甲素的含量[J].中草药，1999，30（7）：495-496.