纤维素酶辅助提取黄花蒿中青蒿素的工艺条件研究

时间:2022-09-24 09:41:28

纤维素酶辅助提取黄花蒿中青蒿素的工艺条件研究

[摘要] 目的 研究纤维素酶辅助提取青蒿素反应中各条件对提取率的影响。 方法 采用紫外分光光度法测定青蒿素含量,研究酶反应过程中时间、加酶量、温度和pH值对提取率的影响,并使用正交实验方法对提取工艺进行优化。 结果 纤维素酶辅助提取青蒿素的最优工艺条件分别是:酶反应时间2 h,纤维素酶用量0.30 g,酶反应温度45℃,酶反应pH值4.5。 结论 纤维素酶辅助提取青蒿素的方法能够有效提高提取率。

[关键词] 青蒿素;纤维素酶;提取

[中图分类号] R965.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2013)08(c)-0014-03

青蒿素(artemisinin,C15H22O5)是治疗疟疾的特效药,具有速效、高效和低毒等抗疟性能[1]。目前,青蒿素主要从黄花蒿(Artemisia annua L.)中提取[2]。近年来,用于天然产物提取的新技术如微波技术、酶技术等迅速涌现,并取得显著的成效[3]。酶技术具有反应效率高、条件温和、专一性强和有效成分破坏少等优点[4],受到广泛关注。

我国是黄花蒿的主产国,将酶技术应用于青蒿素的提取过程,对提高提取效率、充分利用资源有重要意义。本研究对纤维素酶辅助提取青蒿素的条件进行研究,分析各因素对提取率的影响,并采用正交实验的方法对酶辅助提取工艺进行优化,为纤维素酶在青蒿素提取工艺中的应用提供参考。

1材料与方法

1.1 材料

青蒿药材购于广州市清平中药材市场(生产批号120711),经鉴定为菊科植物黄花蒿的干燥地上部分,药材经粉碎后过40目筛备用。纤维素酶Cellulase T4(来源于绿色木霉Trichoderma viride,生产批号20120922)购自天野酶制剂(上海)有限公司。青蒿素标准品(生产批号A2118)购自百灵威科技有限公司,无水乙醇、95%乙醇、氢氧化钠、乙酸、乙酸钠等试剂均为分析纯,购自国药集团化学试剂公司。

1.2 仪器设备

FW135型中药粉碎机,SHA-2型恒温水浴振荡器,HH-4型恒温水浴锅,752型紫外可见分光光度计,SHZ-D型循环水真空泵。

1.3 方法

1.3.1纤维素酶辅助提取青蒿素的方法

称取1 g粉碎后的青蒿样品置于100 ml具塞三角瓶中,加入50 ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液,先常温下浸泡10 min,再加入一定量的纤维素酶,然后在一定温度下水浴振荡进行酶反应。酶反应结束后,抽滤,将滤饼置于100 ml具塞三角瓶中,加入50 ml 无水乙醇,在45℃下水浴振荡1 h,抽滤,取滤液测定青蒿素含量。

1.3.2青蒿素含量的测定方法

青蒿素仅在紫外区203 nm处有较弱的末端吸收,但与碱反应后,生成一化合物Q292,该物质在292 nm处有最大吸收,可用紫外分光光度法检测[5]。取样品溶液0.5 ml加入95%乙醇4.5 ml,再加入0.2% NaOH 20 ml定容至25 ml,50℃水浴加热30 min,取出快速冷却,在292 nm处测定吸光值,每组测定3个平行样品,取平均值。根据标准曲线换算出青蒿素含量。

2结果

2.1青蒿素含量测定的标准曲线

精确称取青蒿素标准样品10 mg,溶于95%的乙醇溶液,定容至100 ml容量瓶中,配制成0.1 g/L的标准溶液。分别取标准溶液0、1、2、3、4、5 ml,加95%的乙醇溶液至5 ml,再加入0.2%NaOH 20 ml定容至25 ml,50℃水浴加热30 min,取出快速冷却,在292 nm处测定吸光值,每组取3个平行样品,取平均值。以青蒿素样品浓度x(g/L)为横坐标,292 nm吸光值y为纵坐标作图,结果见图1。在292 nm下,青蒿素浓度在0~1 g/L的范围内,与吸光值呈良好的线性关系,表明测定方法准确可靠。

2.2 不同酶反应时间对青蒿素提取的影响

按照2.1中的方法,在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纤维素酶,在45℃下水浴振荡反应,酶反应缓冲液pH值为4.5,反应时间分别为1、2、3、4、5 h,测定酶辅助提取后样品青蒿素含量。以不加入纤维素酶进行提取的样品中青蒿素含量为100%进行对照,结果见图2。随着时间的延长,青蒿素的提取率逐渐增加,在3 h左右达到最大值,再延长提取酶反应的时间,青蒿素的提取率基本不变。

2.3 不同加酶量对青蒿素提取的影响

按照2.1中的方法,在100 ml具塞三角瓶中分别加入0.1、0.2、0.3、0.4g纤维素酶,在45℃下水浴振荡反应,酶反应缓冲液pH值为4.5,反应时间1 h,测定酶辅助提取后样品青蒿素含量。以不加入纤维素酶进行提取的样品中青蒿素含量为100%进行对照,结果见图3。随着酶添加量的增加,青蒿素的提取率逐渐增加,当加入0.3 g的纤维素酶时,达到最大值,再增加酶用量,青蒿素的提取率基本不变。

2.4 不同酶反应温度对青蒿素提取的影响

按照2.1中的方法,在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纤维素酶,分别在40、45、50、55℃下水浴振荡反应,酶反应缓冲液pH值为4.5,反应时间为1 h,测定酶辅助提取后样品青蒿素含量。以不加入纤维素酶进行提取的样品中青蒿素含量为100%进行对照,结果见图4。随着温度的增加,青蒿素的提取率呈现先增加后减小的趋势,在酶反应温度为45℃时达到最大值。

2.5不同酶反应pH值对青蒿素提取的影响

按照2.1中的方法,在100 ml具塞三角瓶中加入0.1 g纤维素酶,在45℃下水浴振荡反应,酶反应缓冲液pH值分别为4.0、4.5、5.0和5.5,反应时间为1 h,测定酶辅助提取后样品青蒿素含量。以不加入纤维素酶进行提取的样品中青蒿素含量为100%进行对照,结果如图5。酶反应的pH值对青蒿素的提取率基本无影响,在pH值为4.5时,青蒿素提取率达到最大值。

2.6 纤维素酶辅助提取青蒿素工艺条件的优化

在纤维素酶辅助提取青蒿素的过程中,酶反应时间、酶的添加量和酶反应温度对青蒿素的提取影响较大,而酶反应过程中缓冲液的pH值对青蒿素的提取基本无影响。因此,选取酶反应时间、酶添加量和反应温度作为主要影响条件,利用试验设计软件Design expert 7.5作三因素两水平正交实验L4(23),正交实验水平见表1。

按照软件设计的正交实验表中各因素水平,开展实验,然后对试验结果进行分析。正交实验表和结果分析见表2。对实验结果进行极差分析表明:酶辅助提取反应各条件对提取率的影响试验中,酶反应时间(A)的最优值为水平1,酶添加量(B)的最优值为水平2,温度(C)的最优值为水平2,实验中各因素对辅助提取反应的影响顺序为:酶反应时间>酶添加量>温度。

利用Design expert7.5对实验结果进行方差分析,方差分析结果见表3。方差分析结果表明:在P

3讨论

黄花蒿为菊科艾属一年生草本植物,在我国各地均有分布[6]。青蒿素是从黄花蒿干燥地上部分分离提取得到的一种新型化合物,其具有含过氧基团的倍半萜内酯结构,与已知抗疟药物化学结构完全不同[7],被世界卫生组织称为“唯一有效的疟疾治疗药物”。由于青蒿素的化学合成尚未显示出商业可行性,目前商用的青蒿素主要通过植物提取[8]。工业化提取青蒿素中应用范围最广的是有机溶剂提取法,但存在提取效率低、提取率不高、溶剂消耗大和安全隐患等问题[3]。

天然产物的有效成分主要存在细胞质中,细胞壁的阻碍影响了提取率。纤维素酶是最常见的破壁酶,它可作用于天然产物纤维素为主的细胞壁,破坏细胞壁的致密结构,增加细胞内活性成分的溶出量,提高提取率[9]。纤维素酶Cellulase T4来源于绿色木霉,本实验结果表明,纤维素酶能够有效降解青蒿植物的细胞壁,增加青蒿素的提取率。不同的纤维素酶有不同的最佳反应条件,常见的影响因素有温度、pH、酶的用量、激活剂和抑制剂等[10]。本文单因素及正交实验结果表明Cellulase T4水解青蒿植物细胞壁的最佳条件为酶反应时间为2 h,酶添加量为0.30 g,反应温度为45 ℃,酶反应pH值4.5。在最优条件下,纤维素酶辅助提取青蒿素较未使用酶辅助的提取方法,提取率提高了1.96倍。本实验为纤维素酶在青蒿素提取方面的应用提供了理论指导,为酶技术在中药制药方面的研究和应用开拓了更为广阔的空间。

[参考文献]

[1] 赵兵,王玉春,欧阳藩.青蒿素生物合成机理研究现状[J].广西植物,1999,19(2):154-158.

[2] 钱国平.黄花蒿中提取与纯化青蒿素的研究[D].杭州:浙江大学,2007.

[3] 陈秋实,陈孟兰,范晶.青蒿素提取研究进展[J].武汉工程学院院报,2007,3(2):120-125.

[4] 何玉娟.黄花蒿植物中青蒿素的提取分离过程研究[D].天津:天津大学,2004.

[5] 李春莉,王莎莉,王亚平,等.紫外分光光度法测定青蒿素的含量[J].重庆医科大学学报,2007,32(4):413-415.

[6] 张小波,郭兰萍,黄璐琦.我国黄花蒿中青蒿素含量的气候适宜性等级划分[J].药学学报,2011,46(4):472-478.

[7] 张凤杰,刘祝祥,陈功锡.青蒿药用成分提取方法及检测技术研究进展[J].吉首大学学报(自然科学版),2010,31(4):103-107.

[8] 刘春朝,王玉春,欧阳藩,等.青蒿素研究进展[J].化学进展,1999,11(1):41-48.

[9] 张巾英,张明春.应用纤维素酶提取中草药有效成分的研究进展[J].上海中医药杂志,2007,41(1):79-81.

[10] 杨吉霞,蔡俊鹏,祝玲.纤维素酶在中药成分提取中的应用[J].中药材,2005,28(1):64-67.

(收稿日期:2013-02-26 本文编辑:魏玉坡)

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