安心颗粒对心力衰竭大鼠细胞凋亡基因Bcl-2及Fas表达的影响

摘要：目的探讨安心颗粒防治心力衰竭的作用机制。方法将50只雌性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、卡托普刺组、安心颗粒小剂量组、安心颗粒大剂量组，每组10只。采用阿霉素腹腔注射造模，各用药组同时灌胃给药。连续给药6周后，分别用TUNEL法检测大鼠心肌细胞凋亡，用免疫组化法检测大鼠心肌Bel－2，Fas蛋白的表达。结果安心颗粒能减少心肌细胞凋亡指数，促进Bd－2蛋白表达，抑制Fas蛋白的过渡表达，其抑制细胞凋亡的作用与卡托普利相当。结论安心颗粒能够上调心肌细胞Bd－2蛋白、下调Fas蛋白的表达，抑制心肌细胞凋亡，这可能是安心颗粒防治心力衰竭的作用机制之一。

关键词：安心颗粒；心力衰竭；细胞凋亡

中图分类号：R541.1 R289.5　文献标识码：A　文章编号：i672－1349(2007)08－0701－02

已往的研究表明，心力衰竭(heart failure，HF)时有广泛的心肌细胞凋亡存在，其发生参与了HF的心肌重塑，并在HF的发生、发展中起重要作用。因此，阻断或抑制心肌细胞凋亡的发生在防治HF的研究中有重要的临床意义。安心颗粒是我院附属瑞康医院临床应用于治疗冠心病的复方中药制剂，近年来用于心功能不全病人也取得了较好的治疗效果，但其作用机制尚未完全阐明。现拟从细胞凋亡及其调控凋亡基因方面，探讨安心颗粒防治HF的作用机制。

1　材料与方法

1．1 材料

1．1．1 动物50只健康清洁级雌性SD大鼠，体重(160－180)g，由广西中医学院动物实验中心提供(桂医动字11003)。

1．1．2 药物安心颗粒(含生药4.5g／g)由培力(南宁)药业有限公司提供(批号：050301)；卡托普利由中美上海施贵宝制药有限公司生产(批号：0505031)；盐酸阿霉素(ADR)粉针由深圳万乐药业有限公司生产(批号：0501E2)。

1．1．3 试剂 原位细胞凋亡检测试剂盒为德国罗氏公司(Roche)生产；兔抗大鼠bcl-2单克隆抗体为美国R&D公司生产；兔抗大鼠fas单克隆抗体为美国R&D公司生产；DAB显色剂为北京中杉金桥生物技术有限公司生产；即用型快速免疫组化Maxvision试剂盒，为福州迈新生物技术开发有限公司生产。

1．2 方法

1．2．1 动物模型制作参照《现代医学实验动物学》，将注射用盐酸阿霉素粉针用灭菌注射用水溶解，用生理盐水配成0.8mg／mL溶液，第1周－第3周按3mg／kg剂量给模型组和用药组大鼠进行腹腔注射，每周1次；第4周－第6周按2mg／kg剂量进行腹腔注射，每周1次；正常对照组大鼠注射等量的生理盐水，每周1次，连续6周。

1．2．2 动物分组及给药大鼠在用基础饲料适应性喂养1周后，随机分为正常对照组(A组)、模型组(B组)、卡托普利组(C组)、安心颗粒小剂量组(D组)、安心颗粒大剂量组(E组)，每组10只，分笼饲养。c组用卡托普利灌胃(剂量为6.25 mg&g)，D组和E组予安心颗粒灌胃(剂量分别为0.8g／kg和1.6 g／kg)，用药剂量分别按动物体表面积换算。A组予等量蒸馏水灌胃。每日1次，自由饮食。至实验结束时共有10只大鼠死亡，其中A组1只，B组3只，c组、D组、E组各2只。

1．2．3 指标检测末次给药24 h，用颈椎脱臼法处死大鼠，剖胸取出心脏，洗净后切取部分左心室组织，用4％多聚甲醛液固定12h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片以备形态学观察，并检测如下指标。

1．2．3．1 心肌细胞凋亡指数用TUNEL法，按试剂盒说明操作，以细胞核被染成棕褐色为阳性结果。每个标本观察5张切片，每张切片随机选取5个高倍视野(×400)中的凋亡阳性细胞，计算平均阳性细胞百分数。按公式：凋亡指数(AI)=凋亡细胞核数／R,细胞核数计算。

1．2．3．2 Bcl-2，Fas表达用免疫组织化学染色。常规脱蜡，置于枸橼酸盐抗原修复液(pH=6．0)中高压修复，3％过氧化氢孵育(5－10)rolll。蒸馏水冲洗，PBS液浸泡，滤液，分别加入一抗Bel一2(1：250)，Fas(1：250)，4℃过夜。每张切片加滴Maxvision试剂，37℃孵育15mln。PBS冲洗，DAB显色，二甲苯透明，苏木精复染，中性树脂封固。用北航医学图像分析系统(4．0版本)进行半定量分析，以细胞质及胞膜内侧出现棕黄色颗粒为阳性。每张切片随机取5个高倍镜视野(400倍)，测定光镜下视野的平均光密度与蛋白表达阳性细胞面积百分比，计算蛋白阳性表达指数(posmve expressionindex，PEI)：PEI=平均光密度×面密度×100％。

1．3 统计学处理计量资料用均数±标准差(x±s)表示，多组间比较用单因素方差分析和q检验，以P

2　结果

2．1 各组大鼠病理形态学观察光镜下各组大鼠心肌组织切片可见肥大的心肌细胞群，细胞排列紊乱、断裂、溶解、炎症细胞浸润，但各用药组均较模型组轻。模型组肺病理图片放大(×400)后，可见肺泡壁破裂、融合、水肿、瘀血等改变，肝HE染色可见肝窦扩张淤血。以上病理形态学改变符合慢性HF病理改变，提示造模成功。

2．2 各组大鼠心肌细胞凋亡检测分析A组心肌细胞凋亡指数均比其他各组低，而B组心肌细胞凋亡指数均较c组、D组、E组高，提示大、小剂量安心颗粒与卡托普利片均有抑制心肌细胞凋亡的作用。详见表1。

2．3 各组大鼠Bcl－2，Fas蛋白表达比较B组Bcl－2表达均比其他各组低，而A组、c组、D组、E组组间比较无统计学意义；A组Fas表达比其余4组低，而B组较c组、D组、E组均高。提示大、小剂量安心颗粒与卡托普利片均有增加Bel－2表达和降低Fas表达的作用。详见表2。

3　讨论

利用阿霉素的心肌毒性制备大鼠HF模型，是近年来较公认的动物造模方法之一。ADR属于蒽环类抗肿瘤药，心脏毒性是ADR临床应用的主要不良反应之一，可出现剂量依赖的不可逆转的心肌病、HF。国外研究认为ADR心肌病的病理学、血流动力学和激素的改变均接近于人慢性心力衰竭时所发生的改变。但其作用机制尚未十分清楚，过去认为主要是与自由基、钙超载有关。新近的研究表明，ADR致FIF的机制还与细胞凋亡有关，暴露在低于微摩尔浓度的ADR的心肌细胞和内皮细胞就会发生细胞凋亡。

本实验结果表明，当大鼠腹腔间断注射小剂量ADR而出现HF时，大鼠的心肌细胞凋亡明显增多，而正常对照组大鼠的心肌细胞凋亡数量很少(P