头孢西丁钠无菌检查消除抑菌性的研究

【摘 要】 目的：依据中国药典2010年版无菌检查法的相关规定，通过一系列试验，建立头孢西丁钠无菌检查法。方法：用规定各种试验菌，同时使用β-内酰胺酶进行试验。结果：头孢西丁钠采用薄膜过滤法进行无菌检查，对大肠埃希菌有较强的抑菌活性。结论：头孢西丁钠无菌检查需加入β-内酰胺酶来消除抑菌活性，以保证其无菌检查的准确性。

【关键词】 头孢西丁钠 无菌检查 抑菌性 β-内酰胺酶

Abstract ： The paper is mainly about the research on Cephalosporins XiDing sodium for injection asepsis check eliminate antibacterial property.

头孢西丁钠是头霉类抗生素，是由链霉菌Streptomyceslactamdurans产生的甲氧头孢素C（CephamycinC），，经半合成制得的一类新型抗生素，其母核与头孢菌素相似，且抗菌性能也类似，习惯上也被列入第二代头孢菌素类中。其特点为对革兰阴性菌有较强的抗菌作用，具有高度抗β内酰胺酶性质。

1.试验材料与仪器

1.1供试品：头孢西丁钠（批号为：A201010001、

A201010002、A201010003）哈药集团制药总厂生产。

1.2培养基：由北京陆桥技术有限责任公司提供 硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、营养肉汤培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养琼脂培养基。

1.3验证试验用菌种名称及编号：由中检所提供。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B） 26003]；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

[CMCC（B） 63501]； 大肠埃希菌（Escherichia coli） [CMCC（B） 44102]；生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC（B） 64941]；白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F） 98001]；黑曲霉（Aspergillus niger） [CMCC（F）98003]。

1.4 β-内酰胺酶（酶活力不低于240万单位/ml）：由张家口市格瑞生物化学科技有限公司提供。

1.5仪器和滤器：杭州高得泰林责任技术有限公司提供 HTY-2000A全封闭集菌仪、全封闭集菌培养器（KSF330） 。

2.试验准备：

2.1菌液的制备及菌液计数：

2.1.1取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中， 32.5±2.5℃培养18～24小时，取该培养物1ml，加9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，分别10倍稀释至约10-5～10-7之间，混匀备用。

2.1.2取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂培养基中，25.5±2.5℃培养48小时，取该培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液，10倍稀释至约10-5，混匀备用。

2.1.3取经23～28℃培养5-7天的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用管底部有一圆孔并带有薄的无菌棉花的无菌试管滤出孢子悬液至无菌空试管中，再用上述0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu孢子悬液，混匀备用。

2.1.4菌液计数：分别取上述4种细菌菌液和2种真菌菌液1m加入培养皿，每种菌液做平行2皿，注入相应琼脂培养基15～20ml。细菌30～35℃培养48小时；真菌 23～28℃培养72小时。

2.2判断标准：每1ml菌液中含菌量小于100CFU。

2.3试验记录：见表1。

表1：菌液计数结果

3.试验操作：

3.1供试液制备：取头孢西丁钠20克，分别溶解并转移至500ml 0.9%氯化钠溶液中，制成约40mg/ml的供试溶液1份，摇匀；同法制备头孢西丁钠供试液每批数份，备用。

3.2薄膜过滤：

3.2.1取一次性集菌培养器，先用少量0.1%蛋白胨溶液润湿，排空，将上述其中1份供试液按薄膜过滤法平行加入3个滤筒中过滤处理，每次过滤100ml；供试液过滤后，夹住1筒弃掉不用，剩余2筒，每筒分别用0.1%蛋白胨水溶液300ml冲洗滤膜，每次各100ml，每次冲洗液过滤前应充分振摇，其中1筒冲洗后不加菌液，先注入硫乙醇酸盐流体培养基100ml，作为本次试验的供试品对照，供试品对照应无菌生长；另一筒在过滤最后一次冲洗液时，向冲洗液中加入上述1.1中制备好的大肠埃希菌试验菌液1 ml，完毕后也注入硫乙醇酸盐流体培养基100ml，并在每筒培养基中加入β-内酰胺酶约l50万单位。同法共做6组，各试验菌及相应培养基逐一进行验证，置规定条件下培养观察。

3.2.2对照组：另取一全封闭集菌培养器，直接注入硫乙醇酸盐流体培养基100ml，完毕后加入上述1.1中制备好的大肠埃希菌试验菌液1 ml，作为对照。同法共做6组，各试验菌及相应培养基逐一进行验证，置规定条件下培养观察。

3.2.3阴性对照组：另取一全封闭集菌培养器（两筒），各过滤冲洗用0.1%蛋白胨水溶液300ml后，再分别加入硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各100 ml，并分别向每筒培养基中注入β-内酰胺酶约150万单位，作为阴性对照。

3.3培养：硫乙醇酸盐流体培养基筒30-35℃培养3天；改良马丁培养基筒23-28℃培养3～5天，每天观察并记录结果。

3.4判断标准：

3.4.1对照组培养48～72小时应生长良好。

3.4.2与对照组比较，含供试品各容器中的试验菌均生长良好。

3.4.3阴性对照组及供试品对照组培养5天，均应无菌生长。

3.5试验记录：见表2。

表2：薄膜过滤法的实验结果

“—”表示无菌生长；“+”表示生长良好

讨论

药品无菌检查准确与否的关键是试验中对其抑菌性的有效消除，通过试验可以得出头孢西丁钠采用上述方法进行无菌检查，与对照管比较，含供试品各容器中的试验菌均生长良好，说明该品种采用检验量20克，稀释液用量500ml ，制成约40mg/ml的供试溶液，以0.1%蛋白胨水溶液为冲洗液，单筒冲洗量不少于300ml，并在每筒培养基中加入β-内酰胺酶约l50万单位的检验条件消除其抑菌性时，其抑菌作用可忽略不计，此方法用于头孢西丁钠的无菌检查时可行的；同时根据头孢西丁钠的抗菌谱及中国药典2010年版的相关规定，阳性对照菌选用大肠埃希菌。

参考文献：

[1]中国药典2010年版 第二部

[2]药品微生物检验技术 苏德模 马绪荣

（作者单位：邹晓平 哈药集团制药总厂 张东霞 哈尔滨天地仁医药科技有限公司）