基于代谢途径分析的多杀菌素高产菌株选育

摘要：通过对刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）多杀菌素代谢合成途径的分析，提出了一种代谢控制育种策略和提高诱变筛选效率的方法。以刺糖多孢菌QYLZ 88912菌株为出发菌株，选择不同照射时间分别对其进行紫外线照射处理，然后用含有不同抗性物质的摇瓶对诱变菌进行初筛，最终筛选出了1株高产多杀菌素的多抗性菌株SG+St+Er+-088。该菌株同时具有磺胺胍、链霉素和红霉素抗性，摇瓶发酵试验表明， 发酵7 d多杀菌素浓度可以达到1 132.60 mg/L，较出发菌株提高了85.4%，经传代试验证明此菌株高产遗传特性稳定。

关键词：代谢途径；代谢控制育种；多杀菌素；菌落形态

中图分类号：Q819； Q815 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）10-2309-06

当前中国农药的应用可以简单地总结为农药品种多、质量低、用量大、效率低、农产品中残留量高，对环境污染严重[1]，因此开发高效绿色的新型农药显得尤为重要。多杀菌素（Spinosad）又称刺糖菌素，是由刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）通过有氧发酵聚酮合成途径合成的大环内酯类抗生素，兼有化学农药的速效性和生物农药的安全性，不会对环境产生污染，对鱼、畜、禽安全系数高。多杀菌素作为一种绿色生物农药，其具有杀虫谱广、作用方式独特、杀虫活性高、半衰期短、残留低、无抗药性、对人畜无害、环境污染少等优点[2]，是一种具有触杀及胃毒毒性的新型微生物源杀虫剂，于1999年获得美国“总统绿色化学品挑战奖”[3]，在农牧业生产中具有广阔的应用前景，该类产品的开发也具有良好的经济效益和社会效益。

刺糖多孢菌属于糖多孢菌属（Saccharopolyspora），是迄今发现的惟一可以通过好氧发酵产生多杀菌素的菌株。目前国外多杀菌素的研究领域已延伸到开发杀虫活性更高、生物安全性更好的衍生物上。国内对发酵生产多杀菌素的研究起步晚，最近几年也取得了很大的进展，但较国外研究水平还有很大的差距[4]。国内报道多杀菌素高产菌株较高生产水平为800～1 260 mg/L[5，6]，而国外早在10多年前就实现了工业化生产。多杀菌素的制备方法主要为微生物液体发酵合成，生物合成多杀菌素具有突出的优点，工艺条件较易控制、产品质量稳定、提取较为方便，但微生物液态发酵生产多杀菌素产量很低，主要问题是缺乏高产菌株，以致影响了该物质的应用。因此筛选高产菌株，为中国农药领域开辟新型绿色产品，对农牧业生产具有重要的意义。试验运用理性筛选思路和高效诱变方法，筛得高产菌株，并对其进行生物化学和遗传学分析。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

刺糖多孢菌QYLZ 88912菌株，由天津北洋百川生物技术有限公司保藏。

1.2 培养基

保藏分离培养基：可溶性淀粉20 g/L，葡萄糖5 g/L，酵母提取物3 g/L，玉米浆10 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，琼脂20 g/L，pH 6.5～6.7 ， 121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

种子培养基：可溶性淀粉20 g/L，葡萄糖5 g/L，酵母提取物3 g/L，玉米浆10 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，pH 6.5～6.7，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

发酵培养基：葡萄糖 40 g/L，可溶性淀粉 30 g/L，玉米浸液 15 g/L，棉子浓缩粉 20 g/L，酵母粉 20 g/L，碳酸钙 3 g/L，pH 7.0～7.2 ， 121 ℃高压蒸汽灭菌30 min。

1.3 主要试剂

试验所用主要试剂情况见表1。

1.4 菌株QYLZ 88912对所用抗性物质的耐受上限试验

将出发菌株的孢子悬浮液涂布于含有不同抗性物质、不同设计水平的平板，每个处理做3个平行，在相对湿度70%～80%、29 ℃的培养箱中培养7～9 d，观察抗性平板的菌株生长情况，确定出发菌株对所用抗性物质的致死（耐受）上限。

1.5 菌株的诱变处理

1.5.1 孢子悬浮液的制备 选择生长良好的多杀菌素出发菌株QYLZ 88912斜面菌种，用无菌生理盐水将其孢子洗下，转入装有玻璃珠的无菌三角瓶中振荡30 min，使孢子充分分散，用脱脂棉过滤孢子悬浮液，并调节孢子悬浮液浓度为106～107个/mL，备用。

1.5.2 致死率测定 取处理好的孢子悬浮液于30 W紫外灯下30 cm处分别照射不同的时间进行诱变处理，将诱变后的孢子悬浮液梯度稀释涂于保藏分离培养基平板，于29 ℃避光培养7～9 d，计算致死率。

1.6 分析方法

1.6.1 色谱分析 高效液相色谱仪Agilent technologies 1200 series；色谱柱Agilent Nucleosil 100-5 C18，5 μm，150 mm×4.6 mm；流动相甲醇-乙腈-2%乙酸铵水溶液，甲醇∶乙腈∶2% 乙酸铵水溶液（体积比）为 45∶45∶10；流速1.5 mL/min；进样量10 μL；检测波长250 nm；柱温35 ℃；检测器为紫外线检测器。

1.6.2 标准曲线绘制 用色谱纯甲醇溶解多杀菌素标准品，并配制成1 000 mg/L 的多杀菌素标准溶液，然后再依次稀释成800、600、450、300、200、100 mg/L的多杀菌素标准溶液。按照1.6.1所给出的色谱条件进行HPLC检测，每一个浓度3次重复，以多杀菌素A峰和D峰面积之和为纵坐标、多杀菌素标准溶液的浓度值为横坐标绘制标准曲线。

1.7 多杀菌素的发酵与提取

采用500 mL三角瓶，装液量为50 mL，29 ℃下240 r/min发酵7 d，取10 mL 新鲜的多杀菌素发酵液，加入等体积甲醇，于200 r/min下振荡浸提2 h，15 000 r/min离心8 min，取上清液，过针孔过滤器后，用HPLC法测定上清液中多杀菌素的浓度。

1.8 统计分析

用SAS 2.0 统计分析软件分析并对所得诱变株的产量数据进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 多杀菌素标准曲线

按照1.6.1的色谱条件和1.6.2所给出的标准溶液配制方法，用HPLC检测不同浓度多杀菌素标准溶液的峰面积，所得多杀菌素的标准曲线见图1。线性回归方程为y=5.706 7x-7.082 0，R2=0.999 59，说明该方程能很好地反映多杀菌素与响应信号间的线性关系。

2.2 不同剂量紫外线照射的诱变效果

考虑到菌株对紫外线的耐受能力，研究测定了紫外线分别照射5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 s时的致死率，得到了致死率曲线（图2），由图2可知，随着紫外线照射时间的延长，致死率增大。在紫外线照射时间为25 s时，致死率达到95%，在紫外线照射时间为5、15 s时，致死率分别为35%和70%。对于不同的菌株，由于在不同的致死率下其正突变的概率是不容易确定的，为了增加菌株的正突变，筛选出高产菌株，研究采用的紫外线诱变剂量为5、15、25 s，将经过不同照射时间处理的孢子悬浮液混合后用于初筛。

2.3 菌株QYLZ 88912对所用抗性物质的敏感上限

将出发菌株的孢子悬浮液涂布于含有抗性物质的平板上培养7～9 d，然后观察抗性平板上菌株生长情况，结果见表2。从表2可以看出菌株QYLZ 88912对磺胺胍的耐受上限为5 mg/L，对鼠李糖的耐受上限为 8 g/L，对丙酸钠、链霉素和红霉素的耐受上限分别为10 g/L、6 mg/L和30 mg/L。为了得到能耐受这些物质的抗性菌株，试验选择磺胺胍10 mg/L、鼠李糖12 g/L、丙酸钠15 g/L、链霉素12 mg/L、红霉素40 mg/L作为诱变后混合菌液的初筛浓度。

2.4 菌株的筛选策略与结果

选择5、15、25 s照射时间分别对菌株QYLZ 88912的孢子悬浮液进行紫外线照射处理，然后把3个不同照射时间的孢子悬浮液混合均匀，进行10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6 3个稀释度的孢子悬浮液涂布平板，29 ℃避光培养9～12 d。将长出的诱变菌株接种到含有10 mg/L磺胺胍的种子培养基中培养，29 ℃恒温摇床200 r/min振荡培养3～4 d，能够生长的即为具有磺胺胍抗性的诱变菌。再将此种子液以10%接种量（体积分数，下同）接种到含有12 mg/L链霉素的种子培养基中培养，能够生长的即为兼有磺胺胍抗性和链霉素抗性的诱变菌。再将本次获得的种子液以10%接种量接种到含有40 mg/L红霉素的种子培养基中培养，能够生长的即为兼有磺胺胍、链霉素和红霉素抗性的诱变菌。再将此次获得的种子液以10%接种量接种到含有12 g/L鼠李糖的种子培养基中培养，能够生长的即为兼有磺胺胍、链霉素、红霉素和鼠李糖抗性的诱变菌。最后再将此步获得的种子液以10%接种量接种到含有15 g/L丙酸钠的种子培养基中培养，能够生长的即为兼有磺胺胍、链霉素、红霉素、鼠李糖和丙酸钠5种物质抗性的诱变菌。

按照上述方法，依次将筛到的抗性标记菌株菌液交叉接入含有其他抗性物质的摇瓶里，最终分别得到了SG+系列、SG+St+系列、SG+St+Er+系列、SG+Rh+St+Er+系列的抗性标记菌株种子液。将每步得到的不同抗性标记菌株的种子液都做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6 3个稀释度的孢子悬浮液涂布保藏分离培养基平板，29 ℃培养9～12 d，挑选具有特殊形态的菌落。最终共挑出452株诱变菌株，平板划线分离后，每株保藏3支斜面，按1.7的方法进行摇瓶复筛。选取其中有代表性的16株菌，其菌落形态和产量见表3。最终筛出了1株具有磺胺胍、链霉素和红霉素3种抗性的正突变菌株SG+St+Er+-088，多杀菌素产量为1 132.60 mg/L，SD为40.34，稳定性良好。比出发菌株QYLZ 88912的产量提高了85.4%。

在进行大批量的挑菌筛菌过程中，出现各种形态的菌落（图3），后续试验发现梅花状、正面白色、表面干燥、孢子丰满、质地较为均匀的菌株正突变的概率较大；表面褶皱、状、边缘不规则、中部凹陷、孢子不丰满、奇形怪状的菌落负突变的概率较大。依据菌落形态特征来挑选那些正突变概率较大的菌株，之后再用于摇床复筛，这样可以提高筛菌效率，有效筛得高产菌。

借助菌落形态进行诱变初筛可以提高筛选效率，尤其是对于放线菌这类生长周期较长的菌株。但是这种方法对无菌培养和无菌操作过程要求比较严格，如果其中的一个环节染菌，就会导致整个抗性菌株筛选过程受到影响。

2.5 SG+St+Er+-088的遗传稳定性分析

将高产菌株SG+St+Er+-088在保藏分离培养基上连续传代6次，其产孢速度基本一致；将各代菌株接入种子培养基，其进入对数生长期的时间和最高生物量基本一致；多杀菌素产量稳定在1 080.87～1 191.12 mg/L（表4），表明该菌株遗传特性稳定。

2.6 统计分析结果

用SAS 2.0软件对所得诱变株的产量进行差异显著性检验（出发菌株产量为610.75 mg/L），结果见表5。由表5可知，诱变菌株SG+St+Er+-088和出发菌株QYLZ 88912之间存在显著性差异；诱变菌株产量为1 132.60 mg/L，相对于出发菌株，产量提高85.4%，可以确定所筛出的诱变菌株SG+St+Er+-088为多杀菌素高产菌株。

3 小结与讨论

3.1 代谢控制育种思路

3.1.1 红霉素抗性菌株的选育 大环内酯类抗生素的诱导抗性在许多链霉菌菌株中存在，此类抗生素作用于放线菌的核糖白体，抑制肽酰基合成和转移。红霉素能与50S大亚基结合，并阻断移位作用，将肽酰-tRNA“冻结”在A位点上[7，8]。诱导后的表型是23S核糖体RNA腺嘌呤中的N6-甲基化，使核糖体对所有的大环内酯类抗生素都呈抗性，此时大环内酯类抗生素便开始合成[9]。

红霉素与多杀菌素同属大环内酯类抗生素，红霉素抗性突变株可能部分解除终产物代谢调控作用，从而使多杀菌素的生物合成提前。本研究利用红霉素对菌株QYLZ 88912进行抗性筛选以解除终产物代谢调控作用。

3.1.2 鼠李糖抗性菌株的选育 鼠李糖在刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的过程中，不仅是细胞壁的重要组成成分，也是多杀菌素合成过程中的一个重要的中间产物，其连接到糖苷配基上是糖苷配基转换为多杀菌素的第一步，所以鼠李糖既是初级代谢的终产物，又是次级代谢产物多杀菌素合成的前体。因此，在多杀菌素发酵过程中需要大量的鼠李糖，如果其供应不足，就会影响细胞生长和产物合成[10]，而如果鼠李糖积累过多，受到反馈抑制，也会影响多杀菌素的合成，所以必须去除鼠李糖的反馈调节。本研究利用鼠李糖对菌株QYLZ 88912进行抗性筛选，尽可能改变原始菌株的代谢调控机制，增加鼠李糖的积累量，满足细胞生长和产物合成的需要，提高多杀菌素的产量。

3.1.3 丙酸钠抗性菌株的选育 多杀菌素在结构上是聚酮类物质，多杀菌素聚酮体的形式是以丙酸为起始单位，按A-A-P-A-A-A-A-A-A-A（A-乙酰，P-丙酰）的顺序添加10个酰基缩合而成的，所以丙酸是多杀菌素合成的一个重要的前体。添加外源性前体物质有利于次级代谢物的合成，但过量的前体物质对菌体有毒害和抑制作用[11，12]。本研究利用丙酸钠对菌株QYLZ 88912进行抗性筛选，以期获得对前体耐受性高的多杀菌素突变菌株。

3.1.4 磺胺胍抗性菌株的选育 磺胺胍可以弱化能量代谢途径，筛选具有磺胺胍抗性的菌株，可以强化代谢流，增加多杀菌素的合成代谢能力，同时能增加菌株生长活力，在培养过程中，减少杂菌污染的几率。

3.1.5 链霉素抗性菌株的选育 在抗生素生物合成调控机理的研究中发现，特异性调节基因和其他调节基因的过量表达，都可以诱导抗生素的过量合成。对于核糖体结构的修饰和改造主要分为对翻译元件的修饰改造和对转录元件的修饰改造两方面的内容。链霉素抗性（Str）突变属于对翻译元件的修饰改造[13]。四磷酸鸟苷酸（ppGpp）在细胞形态分化（如气生菌丝和孢子的形成）和启动次级代谢产物（如抗生素、色素和酶等）的生物合成中起着很重要的作用，它的合成基因是relA。当微生物菌株的relA基因发生突变时，微生物便不能合成ppGpp，其次级代谢产物也不能生产。但是如果在该relA突变菌株中引入rpsL基因（编码核糖体蛋白 S12），会发现在ppGpp合成能力没有恢复的情况下就能让其恢复产次级代谢产物的能力[14]，从而增加刺糖多孢菌的产抗生素水平。试验利用链霉素对菌株QYLZ 88912进行抗性筛选，激活其产生抗生素的潜能。

3.2 结论

试验将代谢控制育种的思路与高效筛选策略应用于多杀菌素高产菌株的初筛，在试验过程中，选择不同照射时间对出发菌株进行紫外线照射处理，将得到的孢子悬浮液混合之后，运用含有不同抗性物质的摇瓶对诱变菌进行连续的筛选，筛到了具有不同抗性物质标记的菌株，得到1株高产多杀菌素的多抗性菌株SG+St+Er+-088，该菌株同时具有磺胺胍、链霉素和红霉素抗性，摇瓶发酵表明，发酵7 d多杀菌素浓度可达到1 132.60 mg/L，较出发菌株提高了85.4%，经传代试验表明此菌株的高产遗传特性稳定。

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