血清乙型肝炎病毒cccDNA和细胞内HBV DNA检测的临床意义

【中图分类号】R512.6 + 2 【文献标识码】B【文章编号】1005-0019（2013）12-0093-02

乙肝是一类大病，在我国感染人数有1到2亿，目前国内或者国外对于乙肝的治疗主要方法还是抗病毒保肝护肝的治疗。主要是由于乙型肝炎病毒cccDNA在感染者肝内长期存在，并作为HBV复制的模板，成为根治乙型肝炎病毒感染的困难所在。然而，患者的病情往往会反反复复，即使对于患者的病情控制的非常得当，也只能在一段时间内起到较好的效果。如何能够彻底的治愈，现在还没有很好的方案，因此，准确地检测肝内和/或血清HBV cccDNA的量对病情判断、疗效评估和预后均有重要的意义。

1 HBV 感染与复制过程

1.1感染途径 ：乙型肝炎病毒感染人体主要是通过血液传播，大多数情况通过注射；二是通过母婴传播；其次性传播。无论通过哪个途径，乙肝病毒进入血液循环在体内流动，会经过人体的一个非特异性免疫清除，在血液循环里面要经过吞噬细胞的吞噬。病毒在循环中突破了这些屏障，游离到它需要复制的靶位，即肝细胞。病毒进入肝细胞复制，首先要使肝细胞接受它，也就是说肝细胞上要有受体与病毒结合。病毒可以依靠肝细胞的细胞膜的某一部分，通过胞引作用进到肝细胞内。病毒可以在此释放核酸，核酸在肝细胞内依靠细胞内的原料进行复制和合成。1.2复制与免疫应答：病毒一旦在肝细胞内复制，肝细胞就会有核酸出现，核酸产生后核心抗原就会相应的出现。核心抗原会包裹核酸，但由于核酸分子较小，包裹以后会有多余的一部分结构。多余的部分可以被核内的一些酶切掉，这一部分就是 E 抗原。因此 E 抗原的存在就是乙肝病毒复制的一个标志。 E 抗原从肝细胞释放到细胞以外，血液循环里面就能够检测到 E 抗原的存在。人体的免疫细胞就会通过免疫的应答产生相应的抗体，即 E 抗体。在病毒复制的初期， E 抗原产生的量要大于抗体，因此这时检测到的是 E 抗原而 E 抗体检测不到。如果病毒处于复制的高峰期，释放的抗原在血液循环内增加，特别是大蛋白的抗原，包括表面抗原的大蛋白，就可以诱导的人体细胞对它进行识别和应答。1.3免疫损伤：人体除在血液循环内对抗原进行应答之外，含有病毒复制的肝细胞还会有细胞膜结构的一些变化。这些变化可以诱导人体的免疫细胞，对有病毒的肝细胞进行免疫应答，从而对该细胞进行杀伤，使肝细胞发生免疫损伤，细胞内的转氨酶就会释放到血液循环内，细胞核也会破碎从而把细胞内的物质释放出来，这就是免疫应答的过程，导致了免疫损伤。因此也导致了我们所说的肝功能损害，通过一些生化指标的监测可以监测到肝功的损害。1.4cccDNA 的形成：乙肝是慢性疾病，乙肝病毒在肝细胞内是连续传代。病毒一旦进入肝细胞以后就会开始复制，复制出的病毒就会从肝细胞里面释放出来，而释放出来的病毒除了被人体免疫系统进行识别和杀伤之外，还有一部分会再侵犯其他的肝细胞，并在其他肝细胞里面再进行这样的复制，如此循环。能够在肝细胞里复制的病毒是有活性的，这种乙肝病毒它的 DNA 是松散的双链结构。它是个这种双链结构是松散的而不是闭合的环结构。但是，有些病毒的核酸在进到肝细胞的细胞核以后，在 DNA 聚合酶的作用下，将环形松散的缺口补齐，变成一个超螺旋的共价、闭合、环状 DNA ，即 cccDNA 。

2 HBV cccDNA 的概念及意义

2.1“睡眠”的病毒 DNA：cccDNA 形成之后状态比较稳定，可以称其为肝细胞核内“睡眠”的病毒 DNA ，当病毒活跃性复制时，它又可以作为一个模块来复制病毒。一般在每个肝细胞核内，可以有 5～50 拷贝的 cccDNA。2.2cccDNA 的意义：cccDNA在肝细胞内很稳定，只要肝细胞不被破坏很少释放到外周血液循环，因此很难从血液中检测。但如有大片肝细胞坏死，大量的 cccDNA 就会从细胞核内释放到血液循环，此时人体的免疫系统除对释放的 cccDNA 有应答外，对于人的细胞核也会产生抗体，即抗核抗体。抗核抗体的存在是细胞核暴露所引起的。目前通过肝活检来监测乙肝患者肝组织中的cccDNA水平变化存在着一定困难，因而监测血液中的cccDNA的动态变化也许更具有现实意义。当然，其中还存在一些问题有待研究和解决，比如血液中的cccDNA水平远远低于肝组织中的cccDNA水平，也远远低于血液中的的rcDNA水平，因此必须进一步提高cccDNA定量检测的灵敏度。

3 针对 cccDNA 的治疗现状

目前临床治疗时虽然很多抗病毒药物，但并没有能够进到细胞核以内的药物，还不能够达到清除细胞核内 cccDNA 的目的。现有的抗病毒治疗只是抑制病毒的复制，而不能把藏匿于核内的，复制的最基本模板―― cccDNA 去掉。因此肝病往往是慢性的，而且比较容易复发，所谓复发，就是在肝细胞核内“睡眠”的病毒 DNA 按照病毒自身的复制周期进行复制。 对于肝细胞以外的器官是否有 cccDNA 的存在，目前还在研究阶段。另外，目前还没有一个比较稳定、可靠和敏感的 cccDNA 检测的方法上市，因此 cccDNA 的检测和治疗都是相当困难的。

4 cccDNA 和 rcDNA 的差异

4.1一级结构差异：从核酸的一级结构来看 cccDNA 是一条完整的双链，是共价闭和环。松弛环状 DNA（ rcDNA ），虽然也是环状的，但是它是有缺口的，它不完整的。4.2空间结构差异：从核酸空间结构来看cccDNA 是超螺旋结构；rcDNA 是松弛环状，不是超螺旋的结构。4.3与蛋白结合差异：cccDNA 因为已经形成了稳定的共价闭合环状的结构，所以不能和蛋白结合。而 rcDNA 却可以和蛋白共价结合，因此如果通过沉淀蛋白的方法来提取乙肝病毒的DNA ，所得到的更多的是cccDNA ，因为rcDNA 可以和蛋白结合被沉淀下去。4.3核酸酶抗性差异：cccDNA 对某些核酸酶的抗性较强，一般不易被降解，而 rcDNA 则相对较弱，很容易被降解。

5.有待验证的推断：

首先，通过以上区别可以发现，通过蛋白沉淀的方式可以来获得cccDNA 。另外cccDNA 惰性较强，不容易被核酸酶降解，因此如果有肝细胞的损害，肝细胞核内的 cccDNA 释放到血液循环，也很难被核酸酶所降解，因此在血液循环存在的时间可能要比 rcDNA 存在时间长，这些可能性还没有文献的报道。