时间：2022-05-10 08:37:09
摘要：目的 观察消痰和中方对慢性胰腺炎模型大鼠胰腺纤维化形成及相关蛋白表达的影响，探讨其作用机制。方法 24只Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、胰酶组和中药组，每组6只。采用DDC溶液腹腔注射方法造模，其中胰酶组、中药组大鼠分别予胰酶、消痰和中方灌胃，定期测量大鼠体质量。4周后处死大鼠，取胰腺行病理检测及层黏连蛋白、基质金属蛋白酶-1的检测。结果 经DDC溶液腹腔注射的大鼠，胰腺组织中均可见不同程度的纤维化及炎症细胞浸润。中药组大鼠在一般情况、体质量变化、胰腺病理切片评分及层黏连蛋白、基质金属蛋白酶-1表达方面均优于模型组，差异有统计学意义（P
关键词：慢性胰腺炎；消痰和中方；胰腺纤维化；层黏连蛋白；基质金属蛋白酶-1；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）10-0032-03
目前慢性胰腺炎的病因、发病机制仍不十分清楚，而临床常用的胰酶制剂、胆囊收缩素拮抗剂以及介入手术只能缓解慢性胰腺炎腹痛、腹泻等症状，对严重病例有时甚至只能起到部分缓解的效果[1-4]。而近年来运用中医药防治慢性胰腺炎的研究越来越受到重视[5]。
本院魏品康教授根据多年临床经验，从中西医结合的角度认为慢性胰腺炎致病之本在于“痰浊”。慢性胰腺炎多由急性胰腺炎反复发作及其他胰腺病变积累所致，即使急性胰腺炎等疾病治疗后症状缓解，但发病过程中胰腺局部的大量炎症、充血、水肿等，并没有完全消除，容易积聚形成湿浊滞留，反复日久炼化为痰浊，最终导致慢性炎症和纤维化形成。在此认识的基础上，以二陈汤为底方加减建立消痰和中方，从消除痰浊、疏通运化枢机、和降中焦水液代谢的角度治疗慢性胰腺炎。本实验旨在通过动物实验观察消痰和中方对慢性胰腺炎大鼠胰腺纤维化的作用，探讨消痰和中方治疗慢性胰腺炎的潜在作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物
12周龄雄性Wistar大鼠24只，体质量240～250 g，购自中国科学院动物所，动物许可证号：SCXK（沪）2007-0005，清洁条件下饲养，正常进食进水。
1.2 药物与试剂
消痰和中方由制天南星、制半夏、鸡内金、茯苓、土鳖虫、炙甘草等药物组成，产地明确，经中国人民第二军医大学药学院生药教研室鉴定，张江生物医药基地制备提供。胰酶肠溶胶囊（得每通）购自荷兰苏威制药有限公司，批号46820。三水合二乙基二硫代氨基甲酸钠（铜试剂， Diethyldithiocarbamate，DDC）购自国药集团化学试剂有限公司，批号F20111027。乌来糖（氨基甲酸乙酯）购自国药集团化学试剂有限公司，批号T20090811。伊红染液（HE）购自福州迈新生物技术有限公司。层黏连蛋白（laminin，LN）免疫组化抗体购于英国Abcam公司，批号ab76165。基质金属蛋白酶-1（MMP-1）免疫组化抗体购于美国Abbiotec公司，批号250750。
1.3 造模、分组与给药
大鼠适应性饲养1周后，按随机数字表法随机分为4组，每组6只。除正常组大鼠每周2次腹腔注射2 mL生理盐水外，其余各组大鼠参照文献[6]方法予500 mg/kg DDC溶液腹腔注射造模，每周2次，共4周。根据临床人的用量，经体表面积换算，胰酶组及中药组大鼠分别予90 mg/kg胰酶、1.5 g/kg消痰和中方灌胃，从造模第1日开始给药，1次/d，共计4周。
1.4 一般情况观察
分别在造模前（记为第0日）、造模第7、14、21、28日记录大鼠体质量，观察大鼠饮食、饮水、排便、活动等情况。
1.5 病理检测
4周结束后处死大鼠，以10%中尔马林固定胰腺标本，石蜡切片，HE染色行病理检测。高倍镜下观察HE染色后胰腺组织形态学变化。采用文献[6]报道的胰腺组织学评分标准，评价胰腺腺泡细胞萎缩、纤维化形成，炎症细胞浸润。-：无改变；+：病变范围在2～3个小叶内；++：病变范围在一半小叶内；+++：病变范围超过一半小叶。每张切片在低倍镜下随机选取3个视野进行评判。
1.6 免疫组化SP法检测胰腺层黏连蛋白、基质金属蛋白酶-1蛋白表达
石蜡切片脱蜡和水化后，PBS（pH=7.4）冲洗3次，每次3 min。采用高温高压法进行抗原修复，每张切片加50 μL 3%过氧化氢溶液，室温下孵育10 min，PBS冲洗，甩去PBS液，每张切片加50 ?L的第一抗体（LN、MMP-1兔抗鼠多克隆抗体，稀释度1∶500），4 ℃过夜孵育。PBS冲洗，甩去PBS液，每张切片加50 ?L第二抗体，室温下孵育30 min。PBS冲洗，甩去PBS液，每张切片加100 ?L新鲜配制的DAB显色液，显微镜下观察10 min，阳性显色为棕色或红色。蒸馏水冲洗，苏木素复染，0.1%盐酸分化，自来水冲洗至返蓝。经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
每张切片在高倍镜下随机选取3个视野，结合阳性细胞计数百分比及染色强度进行免疫组化的半定量评价。阳性细胞百分比按0、50%分别计0、1、2、3分；染色程度按浅黄色、黄褐色、深褐色分别计1、2、3分。两部分分数乘积为阳性指数（PI）。
1.7 统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行分析。实验数据以―x±s表示，计量资料若方差齐采用方差分析，组间比较采用LSD-t检验；若方差不齐则采用单向有序非参数Kruskal-Wallis检验，组间两两比较采用秩转换后的方差分析，计数资料统计方法同方差不齐的计量资料。P
2 结果
2.1 一般情况
大鼠在经腹腔注射DDC溶液后均逐渐出现腹泻稀水样便、进食减少、消瘦、少动、毛色黯淡等表现。其中模型组最明显，中药组、胰酶组优于模型组。各组大鼠在腹腔注射DDC溶液当日均出现口唇弥散白色秽浊黏液样物质，第2日消失。处死大鼠解剖后大体观察可见模型组胰腺萎缩，同时伴有脾脏变黑、膀胱充盈等现象。
2.2 体质量变化
造模开始前，各组间体质量无明显差异（P>0.05）。从第2周开始，各组体质量变化开始出现差异，其中胰酶组和中药组体质量均高于模型组（P
2.3 HE病理切片结果
HE切片除正常组外其他各组均可见以小叶间为主的胰腺纤维化，小叶内亦有少量纤维形成及炎性细胞浸润，间质内可见各种炎性细胞浸润，包括中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等，其中模型组最明显，胰酶组和中药组可见胰腺外分泌腺的变性细胞增多。见表2、图1。
2.4 免疫组化层黏连蛋白表达情况
镜下可见各组LN在胰腺腺泡及间质中均有表达，正常组表达最弱，模型组表达最强，中药组较模型组、胰酶组均表达弱（P
2.5 免疫组化基质金属蛋白酶-1表达情况
MMP-1主要在间质细胞的胞核表达，镜下可见正常组中阳性细胞数少，但染色强度高，说明纤维组织少；与之对应的是，胰酶组及中药组中阳性细胞增多，但染色强度低，说明纤维组织增多。对MMP-1的比较可见各组评分差异有统计学意义（P
3 讨论
慢性胰腺炎是一种胰腺组织的进行性慢性炎症，以胰腺实质发生持续性慢性纤维化和炎性损害为主要病理表现。研究表明，导致慢性胰腺炎胰腺纤维化的主要原因是由于胰腺组织中大量成纤维细胞增生及细胞外基质（ECM）沉积合成增多，降解减少，动态失衡所致。LN属结构性蛋白，是ECM中重要成分之一，存在于基底膜的透明层中，在胰腺发生纤维化时与Ⅳ型胶原等相结合，沉积于胰腺血窦中，同时也使胰腺血窦毛细血管化，增加相应胰腺窦阻力，可使血清中LN含量也增高[7]，与胰腺纤维化密切相关。而基质金属蛋白酶（MMP）负责纤维化成分的降解及组织重构，对ECM的完整结构和功能调解起到重要作用[8]。其中MMP-1是MMP家族中主要的间质胶原酶，也是纤维化逆转过程中十分重要的MMP。本实验研究发现，消痰和中方能够显著改善慢性胰腺炎大鼠一般情况，增加大鼠体质量，降低LN、增加MMP-1表达。值得注意的是，胰酶作为临床用于缓解慢性胰腺炎的重要治疗措施之一，在本实验中未见能够调节LN及MMP-1表达，对胰腺纤维化的改善亦不明显，这可能是由于胰酶主要通过增加消化酶，改善消化功能，提高食物吸收来缓解腹泻、消化不良、消瘦等症状，但对胰腺实质组织并无明显作用。
本实验根据参考文献，构建了慢性胰腺炎的动物模型，表现出了慢性胰腺炎典型的消化不良、消瘦及多饮多尿等症状，是研究慢性胰腺炎较为便捷和理想的动物模型。胰腺由于其特殊的位置和疾病表现在中医古籍中未见明确记载，但近年来不少学者认为中医对于脾胃生理功能和病理情况的描述和胰腺存在很大的关联，有脾胃同源说[9-10]。在本实验中，我们观察到造模后大鼠出现的纳差、消瘦等症状，即消化不良和营养吸收障碍的表现，符合中医对脾胃病的认识。同时实验观察到模型大鼠口唇出现弥散白色秽浊黏液样物质，与中医所述“脾开窍于口，其华在唇”相符。以上各项观察结果均提示中医学中所述的脾的功能包含了大部分现代医学中胰的各项功能。
消痰和中方由制半夏、制天南星、茯苓、鸡内金、土鳖虫、炙甘草等药物组成。其制方着眼于“痰浊”阻滞中焦，故方中以制半夏、制天南星为君药化痰散结，消除慢性胰腺炎的痰浊环境之根源；茯苓、鸡内金建运中焦，通调运化枢机，共为臣药；土鳖虫散结消肿，防止纤维化产生，为佐药；炙甘草调和诸药为使药。全方紧扣慢性胰腺炎胰腺组织中因存在以黏液、水肿、炎症浸润为物质基础的痰浊微环境，影响细胞代谢异常，而促使胰腺逐渐形成纤维化的观点，以消除痰浊、调和中焦为旨，在临床中使用多年，疗效显著。
总之，本实验研究发现消痰和中方治疗慢性胰腺炎不仅能有效改善症状，亦可从根本改善胰腺本身的炎症状态及纤维化形成，其潜在的作用机制可能和降低胰腺LN表达、增强MMP-1的表达有关。本实验同时也为中医药从“痰”论治胰腺纤维化提供了一定的依据。
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（收稿日期：2013-01-24，编辑：华强）