温中消痰方对白细胞介素8在S180荷瘤小鼠肿瘤组织表达的影响

作者：党海珍, 魏品康, 张霄峰, 刘占文

【关键词】 肿瘤; 白细胞介素8; 小鼠; 中医药

多种恶性血细胞和实体瘤细胞的生长有赖于自分泌白细胞介素8（interleukin?8, IL?8）的存在和参与，这也是在荷瘤情况下IL?8增高的原因。肿瘤切除后，肿瘤抗原刺激及肿瘤自分泌不复存在，故血清IL?8水平下降，表明手术切除肿瘤可以阻断或减少体内的免疫抑制因子，提升机体的免疫功能。因此，肿瘤组织中IL?8的检测，能更好地了解机体免疫状况和肿瘤负荷情况，对病情估计和观察疗效具有重要的临床意义。本实验给予荷瘤鼠确定的病因学干预及针对性的治疗，即应用温中消痰方治疗“寒邪”干预的荷瘤鼠，采用双抗体夹心亲和素?生物素系统?酶联免疫吸附试验（avidin?biotin system?enzyme?labeled immunosorbent assay, ABC?ELISA）法观察温中消痰方对肿瘤组织IL?8含量的影响，应用实时聚合酶链式反应（real?time polymerase chain reaction, real?time PCR）法检测肿瘤组织IL?8 mRNA的表达，探讨温中消痰方抗肿瘤的作用及作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 昆明种小鼠50只，雌雄各半，6～8周龄，体质量（20±2.2）g，由中国科学院上海实验动物中心提供，动物合格证号为SCXK（沪）2003?0003。在中国科学院上海实验动物中心SPF级动物实验室内饲养，动物使用许可证号为SYXK（沪）2004?0011。传代S180腹水型荷瘤小鼠由中国科学院上海实验动物中心提供，本组瘤源为第4代。IL?8小鼠ELISA试剂盒，上海博光生物科技有限公司产品；IL?8引物及β?actin引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；PCR试剂盒，上海生工生物工程技术服务有限公司产品。

1.2 实验药物 温中消痰方（Wenzhong Xiaotan Recipe, WZXTR），由消痰散结方（Xiaotan Sanjie Recipe, XTSJR）加高良姜、干姜等组成，以水煮醇沉法制备，含生药2.5 g/ml；消痰散结方，由半夏、南星、全蝎和蜈蚣等组成，制法同前，含生药3.29 g/ml；中药均为上海市药材公司产品，经第二军医大学药学院生药学教研室鉴定，长征医院药剂科制备。喃氟啶片，50 mg/片，上海医药集团公司华联制药厂产品，批号060102。生理盐水、蒸馏水，均由长征医院药剂科提供。

1.3 动物分组和处理 昆明小鼠按体质量随机分为5组，即模型组，寒模组，喃氟啶组，温中消痰方组，消痰散结方组，10只/组。无菌抽取荷瘤小鼠腹水，用生理盐水稀释细胞数至2×107/ml，注射于小鼠右侧腋下，0.2 ml/只，建立移植瘤模型。除模型组外，各组动物种瘤前1周寒邪干预（各组灌饲0～4 ℃冰蒸馏水，10 ml/kg体质量，1次/d，连续3周），具体造模方法参照文献并加以改进［1, 2］。第2周将S180传代（4代）实体瘤匀浆后接种于小鼠右侧腋下，继续寒邪干预。接种48 h后各实验组灌胃给药，消痰散结方组和温中消痰方组给药0.4 ml/次，喃氟啶组按喃氟啶117.5 mg/(kg·d)的给药剂量，用蒸馏水配制成0.4 ml，3组给药均为1次/d，6次/周，连续2周；用药组开始给药后上午继续寒邪干预，下午给药；寒模组下午给予生理盐水；模型组不用药；各实验组给药剂量均按70 kg体质量人鼠体表面积换算。实验第22天，颈椎脱离术处死动物，解剖动物，肉眼观察移植瘤的局部生长情况，取瘤测瘤质量、体积，取部分瘤组织分别－20 ℃、－80 ℃保存，作ABC?ELISA和PCR检测。

1.4 寒邪干预S180荷瘤鼠的鉴定 观察小鼠的一般情况，肿瘤的生长情况，每日冰蒸馏水灌胃后，以体温计插入小鼠测肛温，每20 min测1次，5 min/次，共测7次。

1.5 采用双抗体夹心ABC?ELISA法检测肿瘤组织IL?8的含量 所有OD值都应减除空白值后再行计算；以标准品1 000、500、250、125、62、31、16 OPG/ml之OD值在半对数纸上作图，画出标准曲线；在492 nm处测吸光值。

1.6 引物设计 IL?8基因引物序列：正义链，5?CATAGCCATGTGGTTACTATCA?3；反义链，5?AGTAGCCATGATCTTGAGAAGT?3（扩增片断长497 bp）。β?actin引物序列：正义链，5?CATCCTGCGTCTGGACCT?3；反义链，5?GTACTTGCGCTCAGGAGGAG?3（扩增片段长499 bp）。

1.7 抽提RNA的完整性检测 反应条件：95 ℃，5 min，预变性；95 ℃，40 s，变性；55 ℃，40 s，退火；72 ℃，1 min，延伸，共计30个循环；72 ℃，10 min，延伸；4 ℃，保存。将PCR反应管同时置于同一多聚酶链反应仪中，按照上述反应条件设置，开始PCR反应。

1.8 电泳及半定量分析 配0.5×Tris?硼酸电泳缓冲液（Tris?Borate EDTA, TBE）300 ml；胶浓度1.7％（40 ml 0.5×TBE加0.68 g胶）；微波炉中火2 min溶解胶；冷却至60 ℃加入溴乙锭2 μl（0.5 μg/ml）；放入梳子，浇版，待凝固；加8 μl PCR反应产物和2 μl溴酚蓝；电泳50～80 V（5 V/cm）。制备2%琼脂糖凝胶，取PCR扩增产物9 μl，加入含有溴酚蓝指示剂的10×电泳缓冲液1 μl，混匀后加样电泳，电压80 V。以标准DNA电泳分子量作为参照。在紫外光激发下，直接将电泳图像用Gis凝胶影像处理系统扫描进入计算机，并采用该系统软件分析电泳条带的面积和平均灰度，样品灰度值=面积×平均灰度，以β?actin的灰度值作为内参校正IL?8基因产物灰度值，进行半定量分析。

1.9 统计学方法 应用SPSS 10.0软件包，计量资料结果皆以x±s表示，采用方差分析，并作组间两两比较。计数资料采用χ2检验确切概率法分析。

2 结果

2.1 各组S180荷瘤鼠形态学及肛温的变化 各组S180小鼠接种肿瘤第1周，右上肢外侧皮下陆续出现肿块，并逐渐长大。寒邪干预的第1周，寒模组动物出现耸毛、蜷缩、四肢发冷和耳壳发白，肛温下降1.5 ℃左右，2 h后恢复正常；温中消痰方组动物畏寒的形态学表现出现较晚、历时短，肛温平均下降1 ℃左右，1 h后恢复正常。消痰散结方组、喃氟啶组动物形态学及肛温变化与寒模组基本一致；模型组动物肛温平均37.8 ℃，未见下降。各给药组动物的生存状况明显优于寒模组和模型组，结果发现寒模组、模型组肿块的生长速度快于中药组、喃氟啶组，造模第3周左右，寒模组和模型组小鼠明显消瘦，进食少，倦怠乏力，活动受限。

2.2 各组S180荷瘤鼠瘤质量、抑瘤率 第3周处死所有的实验动物，剥离肿瘤，肿瘤呈实质性，圆形或椭圆形，切面呈鱼肉状，瘤体较大者中央有小片坏死区。寒模组与模型组瘤质量、肿瘤体积分别与温中消痰方组、消痰散结方组、喃氟啶组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。小鼠肿瘤称质量后计算瘤质量抑瘤率，瘤质量抑瘤率（％）＝（1－给药组平均瘤质量/寒模组平均瘤质量）×100。消痰散结方组、温中消痰方组和喃氟啶组的抑瘤率分别为61.18%、63.23%和54.71%，提示温中消痰方、消痰散结方对肿瘤生长有明显抑制作用。见表1。

表1 移植瘤瘤质量、肿瘤体积及抑瘤率（略）

Table 1 Tumor weight, volume and inhibitory rate of transplanted tumor

**P＜0.01, vs untreated group; P＜0.01, vs cold water?treated group.

2.3 双抗体夹心ABC?ELISA法测定S180小鼠肿瘤组织中IL?8的含量 模型组明显高于各实验组，差异具有统计学意义（P＜0.01）；寒模组与温中消痰方组和消痰散结方组相比，差异也有统计学意义（P＜0.01, P＜0.05）；温中消痰方组、消痰散结方组IL?8的含量明显下调，但两组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。以标准品1 000、500、250、125、62、31、16 OPG/ml之OD值在半对数纸上作图画出标准曲线，y=207.67 x + 1.252 4，R2=0.999 4。见表2。

2.4 扩增的IL?8基因片段在各组的阳性表达情况 抽提总RNA的纯度及浓度检测结果表明所抽提的RNA纯度较好，可用于PCR。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳显示，所有标本中β?actin在约499 bp处有特异性扩增条带，且均有大致相同程度表达。各组中IL?8 mRNA在约497 bp处有特异性扩增条带，与预期设计一致，表达程度不同。消痰散结方组、温中消痰方组IL?8的cDNA扩增条带面积灰度值较寒模组、模型组、喃氟啶组明显下降（P＜0.05）；其中，温中消痰方组IL?8的cDNA扩增条带面积灰度值较消痰散结方组降低，但两组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。见图1和表3。

表2 移植瘤肿瘤组织中IL?8的变化（略）

Table 2 Changes of IL?8 in tumor tissue of transplanted tumor

**P＜0.01, vs untreated group; P＜0.05, vs cold water?treated group; P＜0.01, vs cold water and WZXTR?treated group.

图1 S180小鼠肿瘤组织中IL?8 mRNA的表达（略）

Figure 1 Expression of IL?8 mRNA in S180 tumor tissue

1: Cold water and tegafur?treated group; 2: Untreated group; 3: Cold water and WZXTR?treated group; 4: Cold water and XTSJR?treated group; 5: Cold water?treated group.

表3 IL?8基因片段的阳性表达（略）

Table 3 Positive expression of gene fragment of IL?8

*P＜0.05, vs untreated group; P＜0.05, vs cold water?treated group.

3 讨论

IL?8是一种多功能细胞因子，除了激活和趋化嗜中性粒细胞，在许多疾病的炎症反应中发挥重要作用外，IL?8还作为自分泌生长因子促进肿瘤细胞增殖，并作为肿瘤血管发生因子促进肿瘤组织的新生血管形成，从而促进肿瘤的发生发展［3］。郭晓临等［4］研究显示，IL?8在胃癌组织中的过表达与细胞毒素相关基因A的幽门螺杆菌（cytotoxin associated gene A helicobacter pylori, cag AHp）感染有关，cag AHp感染可上调IL?8的表达水平，通过IL?8的表达在胃癌的发生发展中起作用，故预防cag AHp感染对控制胃癌的发生非常重要。IL?8通过转活内皮生长因子刺激非小细胞肺癌的癌细胞增殖［5］，给接种人类非小细胞肺癌的小鼠中和抗体治疗直接抑制IL?8可明显缩减肿瘤的大小［6］。本实验结果显示，寒模组及模型组S180荷瘤鼠的瘤质量及肿瘤体积明显大于各给药组（P＜0.01），寒模组的瘤质量及肿瘤体积大于模型组，但差异无统计学意义。温中消痰方有良好的抑瘤作用，其抑瘤率为63.23%，高于消痰散结方组及喃氟啶组。ELISA分析理论上可以准确反映蛋白质分泌的水平，而半定量PCR只能反映大致趋势。我们分别采取ELISA分析蛋白水平和半定量PCR对荷瘤鼠肿瘤组织IL?8表达水平进行检测。IL?8测试结果显示，标准曲线R2值为0.999 4，实验数据在检测的线性范围内，说明本批次检测结果可信。模型组IL?8水平明显高于各实验组，差异具有统计学意义（P＜0.01），表明S180荷瘤鼠IL?8含量增高，荷瘤鼠移植瘤的生长有IL?8的存在和参与；寒邪干预后，IL?8含量降低，与模型组相比，差异有统计学意义（P＜0.01），所以笔者认为寒性致病因子对肿瘤组织中IL?8的分泌有一定的抑制作用。治疗后，温中消痰方组IL?8含量明显下降，温中消痰方组分别与寒模组、喃氟啶组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）；与消痰散结方组相比，差异无统计学意义，表明温中消痰方可明显降低IL?8含量，其疗效优于喃氟啶，中药治疗组中IL?8含量温中消痰方组较消痰散结方组降低，但二者相比，差异无统计学意义，表明两方均可抑制寒邪干预荷瘤鼠肿瘤组织IL?8的表达；喃氟啶组IL?8水平接近寒模组，差异无统计学意义（P＞0.05），所以笔者认为喃氟啶主要通过干扰和阻断DNA、RNA及蛋白质的合成抗肿瘤，主要作用于S期，可能对炎性因子没有明显的调节作用。PCR结果显示，各组中IL?8 mRNA在约497 bp处有特异性扩增条带，与预期设计一致，表达程度不同。消痰散结方组、温中消痰方组IL?8的cDNA扩增条带面积灰度值较寒模组、模型组、喃氟啶组明显下降（P＜0.05）；其中，温中消痰方组IL?8的cDNA扩增条带面积灰度值较消痰散结方组下降，但与消痰散结方组相比，差异无统计学意义。实验结果与ELISA法测定结果基本相符，进一步验证了温中消痰方对IL?8的调节作用。上述实验结果表明温中消痰方在抑瘤率与调节炎症因子IL?8方面都有良好的效果，其疗效优于喃氟啶，与消痰散结方相比，略有优势，但差异无统计学意义，如加大样本量可进一步研究两方具体的差异。前期我科实验研究表明，消痰散结方有良好的抗肿瘤作用［7］。本课题在前期研究工作的基础上，对实验动物给予确定的病因学干预，治疗中以“寒者热之”的中医理论为基础，在消痰散结方的基础上，加上以高良姜等为主的温中药有针对性地治疗肿瘤，结果表明温中消痰方有良好的抑瘤作用，并对肿瘤免疫抑制因子IL?8有明显的调节作用，该调节作用优于喃氟啶。

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