肝氧化损害与抗氧化保护对策研究

引 言

铁是机体必需的微量元素之一，在细胞代谢中行使着重要功能(是氧运输蛋白和氧化还原酶的关键组成部分)。因此，铁的正常调节在机体生命过程中至关重要。当机体发生铁过载时，过量的铁能够引起 ROS (reactive oxygen species) 的大量产生，当产生的 ROS 量超过机体抗氧化的防御能力时，会引起细胞发生氧化应激反应，导致细胞发生 DNA 损伤、脂质过氧化、蛋白质修饰和其它破坏效应等。同样，在肝脏组织中发生的氧化应激反应也会引起肝脏细胞脂质、蛋白和核酸等结构的损伤，造成肝脏组织的破坏。而且还能激活炎症细胞和肝脏星型细胞，继而导致炎症因子的大量分泌，组织纤维化的过度形成，加速肝脏的进一步损伤。同时，肝脏疾病的各种致病因素 (乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和酒精)也能够激起肝细胞的氧化应激反应。本文将对铁过载和其它肝病病因引起的氧化应激及其在肝损伤中的作用的相关研究进展做一概述。

肝脏正常铁代谢

肝脏是机体主要的铁贮存器官，同时，在铁稳态的调节中起着中心和枢纽作用。目前，人们对肝脏铁代谢(铁吸收、铁贮存和铁动员) 已经有了较为系统的认识。机体内的铁主要来源于巨噬细胞对衰老红细胞中铁的回收利用，以及肠道对食物中铁的吸收。肝细胞根据机体内铁水平的高低而触发不同的摄取方式，主要有两种摄取循环铁的方式：一种是在生理铁浓度的条件下，以转铁蛋白结合铁的形式吸收；另一种是在铁超载的条件下，以非转铁蛋白结合铁的形式，通过二价金属离子转运体(divalent metal-ion transporter-1，DMT1)及锌和铁的转运体(zinc transporter 14，ZIP14) 这两种分子的参与进行铁吸收[1]。对于第一种方式，主要依赖于转铁蛋白受体(transferrin receptor，TfR) 的表达量。目前发现 TfR 具有两个同源蛋白 TfR1 和 TfR2，TfR1 在幼红细胞表面高表达，而 TfR2 主要表达在肝细胞表面。当血清转铁蛋白(transferrin，Tf) 与 TfR 结合后，引发肝细胞膜内陷形成内含体，进而通过胞吞作用进入细胞内，细胞内的pH值在离子泵的作用下逐渐降低。在酸性条件下，Tf与 TfR 结合体的构象发生改变，释放出 Fe3+，之后，Tf-TfR 复合体回到细胞表面；在微碱性pH 值时，Tf-TfR 复合体分离，又重新开始运铁过程[2]。进入肝细胞内的铁主要以铁蛋白和含铁血黄素的形式储存，另外，游离铁以“活性铁池”(labile iron pool，LIP)的形式存在于肝细胞内[3]，完成各种铁相关的生物功能。对于铁的分泌，目前仅发现一种膜铁输出蛋白，即膜铁转运蛋白 1 (ferrroportin1)，其主要在小肠上皮细胞和巨噬细胞表面高表达，这也可能是肝脏易于发生铁过载的主要原因之一(见图 1)。铁缺乏和铁过载对机体都将产生不良影响，因此，机体需要具有严格的铁调控机制，既能够提供足量的铁来发挥其生理功能，又必须防止因铁过载而产生的生理毒性。随着对铁调素(hepcidin)的进一步研究，发现其对铁代谢具有紧密的调节作用。具有生物活性的hepcidin是一个含有 25 个氨基酸的短肽，主要由肝脏合成分泌。Hepcidin 最初是在血浆中被分离出来的[4]，其调节铁代谢的功能主要表现在与ferroportin 结合，引起它的内化降解，从而减少铁从细胞内释放到血液循环的量[5]。正常生理环境下，机体内 hepcidin 的波动情况反映了机体内的铁水平。Hepcidin 的调控主要通过 BMP 途径来完成，BMP 途径是 hepcidin响应机体铁水平的一个主要途径[6]，BMP 分子 (BMP1 或 BMP2) 在细胞膜结合相应的受体后激活 SMAD 1、5 和 8 的磷酸化。磷酸化的 SMAD 1、5 或 8 与 SMAD4 形成复合体进入细胞核内，然后结合到 hepcidin 启动子区，调节 HAMP 基因的转录[7,8]，继而调节 hepcidin的合成释放量。尽管人们对肝脏铁代谢的认识已经有了很大进步，但对肝脏如何接受到机体铁需要量信号的机制仍然不十分清楚。

肝脏铁超载

在一些病理条件下，肝脏贮存的铁异常增多将导致铁超载。肝脏铁超载从根本病因上分为遗传性铁超载(primary iron overload)和获得性铁超载(secondary iron overload)。

遗传性铁超载紊乱

铁代谢中的一些基因，尤其是铁调素表达调控过程中一些关键基因的突变或缺失，将导致铁超载。血色素沉积症是其中最主要的一类，可根据病理生理标准和表现型标准被分成原发性血色素沉积症和继发性血色素沉积症[9]。原发性血色素沉积症的主要特点为红细胞生成正常、转铁蛋白饱和度增高及实质细胞铁分布增加，这与 hepcidin 量的减少或者hepcidin活性的降低相关[10]。目前，最常见的原发性血色素沉积症为 HFE 相关的血色素沉积症，占原发性血色素沉积症至少 90%的比例，其它形式的色素沉积症，包括 HFE2 基因和HAMP基因突变引起的青少年型血色素沉积症[11]、TFR2 基因突变导致的血色素沉积症和SLC40A1基因突变引起的血色素沉积症等，都比较少见[12]。另外，还有继发性血色病，如转铁蛋白突变引起的转铁蛋白缺乏症、血浆铜蓝蛋白突变引起的血浆铜蓝蛋白缺乏症，以及一些影响红系生成进而引发铁沉积的症状，包括重症地中海贫血、丙酮酸激酶缺陷及先天性红系生成异常性贫血等。

获得性铁超载紊乱

另一类主要的铁超载是由于后天因素造成的获得性铁超载，可以由很多原因促成。慢性多量的铁摄取可以引起具有临床意义的肝脏铁储存增多[13]；同样，在慢性肝脏疾病患者中发现肝脏铁储存量增加，可能是由于受损伤的肝细胞分泌 hepcidin 的量减少，而 hepcidin能够减少肠道对铁的吸收，或者是因为肝病本身的致病因素，如病毒感染，由于病毒复制过程需要铁的参与，从而导致大量的铁蓄积于肝脏。此外，肝硬化末期会发生严重的肝实质细胞铁超载倾向[14]，同时，还会导致转铁蛋白和 hepcidin 的合成量降低，这有可能是因为肝细胞功能缺陷所致[15]。

肝脏铁沉积和/或其它致病因素引起氧化应激导致的肝脏损伤

铁过载引起的肝脏氧化应激损伤

正常情况下，ROS 通常是细胞色素 p450 参与的有氧呼吸反应的副产物，也可由膜结合的NADPH 氧化酶复合体产生[16]，主要包括超氧阴离子(O2•－)、羟自由基(•OH)和过氧化氢(H2O2)等。ROS 在重要的细胞活动中起着关键作用，例如线粒体呼吸、信号转导和转录因子激活等。如果它的产生没有被抗氧化剂及时地控制和平衡，那么，ROS 可能会与细胞的主要成分相互作用而发生氧化应激反应，进而导致细胞损伤。虽然氧化应激的确切机制不是很清楚，但已知铁过载在促进氧化应激的过程中的确起着关键作用。由于铁是一种过渡金属，外周有一个未配对的电子，是一种极好的促进ROS 产生的催化剂，能够导致细胞脂质过氧化的发生及促凋亡信号的激活。正常肝细胞能够通过酶/ 非酶的抗氧化过程清除或者中和活性氧分子，从而维持一个安全的细胞内ROS 水平。铁主要储存于肝细胞和枯否氏细胞中，当肝细胞发生铁过载时[17]，过量的铁通过其催化性质形成了大量 ROS，导致细胞及细胞器发生氧化应激，在生物体中比较常见的是脂质过氧化反应。脂质过氧化过程中，ROS 与生物膜的磷脂、酶、与膜受体相关的多不饱和脂肪酸的侧链，以及核酸等大分子物质发生反应，最终形成脂质过氧化产物，从而使细胞膜的流动性和通透性发生改变，影响细胞的结构和功能。脂质过氧化反应不仅发生在细胞的胞浆膜，在各种细胞器膜上也有发现，其结果是增加不同细胞器(如线粒体、溶酶体和内质网) 膜的脆性，从而导致细胞功能损伤[18]。其中，线粒体膜的脂质过氧化可以使膜通透性增加，引起电化学成分的丢失和具有促凋亡能力的细胞色素 C 的释放，损伤线粒体的同时，又形成更多的ROS，从而进一步加速细胞损伤和促凋亡信号的激活[19]。除此之外，脂质过氧化还能损害 DNA 和蛋白质结构，因为脂质过氧化产物 4- 羟基壬烯醛(4HNE)和丙二醛(MDA)能够与 DNA 碱基相互作用[20]。氧化应激不仅破坏肝实质细胞，对肝脏星形细胞也有影响。星形细胞位于肝脏狄氏(Disse)间隙内，无论对于正常肝脏还是发生纤维化的肝脏，其都是细胞外基质的主要来源[21]。正常情况下，肝脏星形细胞的主要作用是调节维生素 A 的内环境稳态及储存[22]，当其受到刺激时，肝脏星形细胞就会分化为肌成纤维细胞，同时具有了收缩、增殖、促炎症和致纤维化的特性，其中，发生氧化应激的枯否氏细胞和肝细胞释放的促纤维化因子和促增殖因子都是其分化的始动因素[23]。已有研究证明，由于氧化应激引起细胞凋亡的 NF-κB途径能够促进肝细胞和枯否氏细胞产生细胞毒素因子(TNF-α)、促炎症因子 IL-6 和致纤维化因子 MIP-1，继而引起肝脏星形细胞的激活[24]，加速了肝脏纤维化的发生。

丙型肝炎病毒引起的氧化应激损伤

慢性丙型肝炎是世界范围内最主要的肝脏疾病之一[25]，其致病因素丙型肝炎病毒(HCV)是发展为肝硬化和肝癌及肝转移的主要原因。已有研究发现，在 HCV 白、NS3蛋白和 NS5 蛋白的表达和复制模型中，氧化应激产物量明显增加[26]，而且发现 HCV 感染患者血浆中脂质过氧化产物增加[27]，此外，外周血单核细胞中的超氧化物歧化酶活性也增强[28]。已有研究显示，HCV 能够介导氧化应激反应，造成 ROS 的增加和细胞抗氧化能力的改变[29～32]。HCV 蛋白能够与包括线粒体、内质网和脂质体在内的亚细胞结构结合，这种结合导致了细胞器完整性和功能性的改变，从而损伤肝细胞功能。其中，HCV 白与线粒体具有紧密的结合性，进而引起氧化应激反应，最终导致活性氮物质和脂质过氧化物的产生增加[27,32,33]；同时，抗氧化物 GSH 和 NADPH 的浓度降低；此外，线粒体吸收钙离子的量增加，增加的钙离子能够扰乱线粒体膜的通透性，进而引起线粒体功能紊乱[34,35]。HCV 非结构蛋白 NS5A 通过 API 转录因子作用于 p38，MAPK 和 JNK 信号途径参与到氧化还原平衡中来，最终改变了抗氧化酶水平[36～39]。有趣的是，HCV 白与非结构蛋白引起不同的抗氧化防御反应，这使我们更加容易地判断出 HCV 造成肝细胞损伤的具体因素[37]。此外，氧化应激产物还可能加速肝脏星形细胞的增殖，虽然 HCV 引起肝纤维化的机制很多，然而研究证实，氧化应激是最有可能的致纤维化因素[40]，因此，氧化应激在HCV 引起的肝脏纤维化中也起着重要的作用[30]。

乙型肝炎病毒引起的肝脏氧化应激损伤

乙型肝炎病毒（HBV）是最常见的导致肝脏疾病的主要原因之一，并且与肝细胞癌具有强烈的关联性[41]。HBV 是一个局部双链的嗜肝 DNA 病毒，且它的基因组编码一些病毒复制必需的病毒蛋白，包括逆转录聚合酶、衣壳蛋白、薄膜蛋白和 x 蛋白[42]。其中，x 蛋白被认为是关键的病毒蛋白，具有多功能的调控活性，主要调节基因转录、蛋白降解、信号转导、宿主细胞增殖、细胞循环进展、细胞的衰老及自噬和凋亡[43,44]。而且，x 蛋白通常存在于线粒体中[45]，能够特异地引起线粒体膜功能的破坏(线粒体生理活性、代谢功能和其它相关功能等)，最终导致细胞死亡[46]，产生的 ROS 继而引起肝脏的氧化应激损伤[47]。研究证明，氧化应激广泛参与到炎症性疾病和癌症疾病中[49]，而且，氧化应激产物在炎症和癌症组织中持续产生。此外，在肝脏疾病中激活的巨噬细胞的浸润是氧化应激产物的另一个来源，也促进了肝细胞的氧化应激损伤[50]。

酒精引起的肝脏氧化应激损伤

酒精性肝脏疾病是一个从脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纤维化到肝硬化，甚至到肝癌的发展过程[51～53]。目前，对酒精代谢有了更多的了解，但是对酒精造成肝脏损伤的机制并没有完全阐明。目前最受关注且做了大量实验研究的机制是氧化应激所致的肝损伤。在各种研究模型(细胞、动物和人体) 中已经证明，经急 / 慢性酒精处置后，ROS 量增加，并提高脂质、蛋白质和 DNA 结构的过氧化反应。体外研究发现，酒精能够引起氧化应激及肝细胞毒性，即在肝细胞中发现酒精代谢是通过乙醇脱氢酶反应产生乙醛，导致氧化应激产物的增加，继而引起肝细胞损伤及肝细胞凋亡[54,55]。此外，关于酒精引起氧化应激后促进肝脏损伤的最令人信服的数据，是来自胃内酒精灌注的动物模型。有研究证明，将脂质过氧化必须的多不饱和脂肪酸替换成饱和脂肪酸处置的小鼠，具有低的脂质过氧化水平，并降低了酒精处置后引起的肝脏损伤[56,57]。另外，酒精诱发的线粒体脂质过氧化还导致了线粒体氧化磷酰化损害及巨型线粒体的出现[58]。一些研究已经证明，酒精引起的肝脏损伤与脂质过氧化水平增高，以及蛋白羰基结构、羟乙基自由基结构、脂质自由基结构的形成和抗氧化防御因子(尤其是谷胱甘肽)量的降低有关[56,57,59～61]。因此，酒精和多不饱和脂肪酸共同作用是发生肝损伤所必须的。还有研究发现，经急 / 慢性酒精处置的小鼠，线粒体 DNA 发生了氧化修饰[62]。而且在酒精中毒患者的肝脏中，线粒体 DNA 的单个或者多个碱基缺失的发生率至少是健康对照组的 8 倍[63]。此外，引起氧化应激继而造成肝脏损伤的途径有很多，例如，由酒精和醛脱氢酶导致的氧化还原状态的改变(NAD+/NADH比率降低)、反应产物乙醛的蓄积、线粒体损害引起 ATP 产量的增加等等。

治疗策略

去铁治疗

研究证明，在丙型肝炎患者中，肝脏铁沉积与丙型肝炎病毒感染引起的肝脏炎症和损伤有一定的关联性[64]。此外，肝脏铁积累量与肝脏纤维化具有紧密的相关性[65]。在典型的铁沉积相关肝脏损伤紊乱疾病中，如遗传性血色素沉积症，已明确地证明肝脏铁通过氧化应激产物的形式造成了肝脏的损伤，引起脂质过氧化和细胞膜的改变[66]。长期的肝细胞破坏将是发展成肝硬化甚至肝癌的首要致病因素。去铁治疗对于存在铁沉积的各种肝脏疾病是非常必要的。有研究报道，铁螯合剂 - 去铁胺能够阻止小鼠肝脏进一步损伤的发生和癌前病变的发展[67,68]，其中，去铁胺具有抗增殖效应，能够阻止细胞周期并能够促细胞凋亡[69]。已有临床研究应用去铁胺对肝细胞癌进行治疗，一个研究组最近对其治疗效果进行了评价，发现患者血清肿瘤标识物的水平降低，其中一个发生肺转移患者的转移灶消失[70]。因此，对于与铁相关的各种肝脏疾病，去铁治疗是一种有效而又有前景的治疗模式，可以预防由于铁引起的氧化应激而导致的肝细胞破坏，尽管治疗的终极目标还应该是病因的治疗，然而在长期的病因治疗过程中，去铁治疗将是其重要的辅助治疗手段。

抗氧化治疗的研究

在某种程度上，氧化应激存在于各种疾病中，肝脏疾病也不例外[71]。许多肝脏疾病存在高水平的 ROS，并且，氧化的蛋白量和脂质的修饰量与疾病的严重程度和疾病进展有一定的关联性[72]。这个发现为抗氧化治疗提供了可能性。几种常用的抗氧化剂可以用来进行辅助治疗。维生素 E 是一种常用的抗氧化剂，能够通过与未配对的电子形成复合体，稳定这些自由基复合物，进而减少 ROS 的量，最终阻止脂质过氧化的发生[73]。研究发现，经维生素E 治疗酒精性肝炎后，患者血清中肿瘤坏死因子量减少[74]，且有研究证明，在丙型肝炎患者中，维生素 E 能够阻止星形细胞的激活[75]。但是，目前还没有明确的研究结果证明抗氧化剂能够作为丙型肝炎患者进行干扰素基础治疗的有效佐剂。此外，维生素 C 作为电子的主要供体，可以终止自由基链式反应，进而减少 ROS 的产生。MitoQ，是一种靶向线粒体抗氧化剂，它本身的阳性电荷和亲脂特性允许其在线粒体基质和线粒体内膜积聚，从而行使其抗氧化作用[76]。目前，在肝脏疾病中，只有非酒精性脂肪性肝病获得了抗氧化剂治疗有效性最好的临床证据支持，但也有初步的证据支持其在酒精性肝脏疾病中也有效。在慢性酒精喂养的小鼠模型线粒体中，谷胱甘肽量的降低要先于ATP 合成障碍，当及时补充线粒体谷胱甘肽时，能够及时阻止其合成损伤[77]。但也有研究发现，同样发生肝脏氧化应激的两种肝病都经抗氧化治疗后，却得到了不同的治疗结果，这种偏差的出现可能是由于研究设计的不同、病人群体和临床治疗终末点的不同，还可能是抗氧化剂的剂量和种类不同，以及氧化应激测量方法学的不同所致[64]。肝脏的过氧化损伤和应用的抗氧化策略总结在图 2 中。

展 望

综上所述，就目前肝脏损伤的研究，导致肝损伤的确切机制还不清楚，但各种因素导致的氧化应激在肝损伤中的作用已愈加明晰。因此，能够明确导致氧化应激的致病因素对于有效减缓肝损伤至关重要。此外，在各种肝脏疾病中，由于肝脏铁沉积所发生的氧化应激已愈加受到科研及临床工作者的重视，而且发现各种肝病病因同时也会对肝脏产生氧化应激，推测肝脏铁沉积和各种肝病病因可能会有相互促进的效应，如果能够通过去铁治疗和抗氧化剂有效减缓氧化应激的发生，将会对治疗效果和延缓疾病发展起到事半功倍的作用。