芽孢杆菌WF63脂肪酶分离纯化及酶学性质

收稿日期:2010-03-15.

基金项目:国家自然科学基金（30870545）；福建省教育厅科技项目（JA05199）.

作者简介:黄鹭强（1974-），男，博士研究生.主要研究方向：微生物工程与食品微生物技术.

通讯作者:黄建忠（1966-），男，教授，博士生导师.主要研究方向：微生物工程与酶工程.

摘要: 芽孢杆菌wf63脂肪酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、Sephaery1 S200柱层析、CM Sephrose FF柱层析，得到纯化的脂肪酶，纯化倍数为9.45倍，活性回收率为4.27%.对该酶性质研究表明:该酶水解橄榄油的最适温度为50℃，最适pH为8.0，在60℃以下和pH 4~10之间有很好的稳定性.K＋,Mg2＋对该脂肪酶的水解活性有促进作用，而Na＋，Mn2＋，Ca2＋对脂肪酶则没有显著的促进作用,Fe2＋对酶活的抑制作用不明显.浓度为0.1%时，Triton X-100对脂肪酶活力有明显促进作用；Brij 35,Tween-80对酶活力的影响不明显；离子型表面活性剂SDS则表现出抑制作用.

关键词: 芽孢杆菌；脂肪酶；分离纯化；性质

中图分类号:Q55

文献标识码:A文章编号:1672-8513(2010)04-0290-04

Purification and Characterization of Lipase from Bacillus sp. WF63

HUANG Luqiang，XIE Bifeng，HUAN Jianzhong，WU Songgang

(School of Life Science, Fujian Normal University, Fuzhou 350108, China)

Abstract: A lipase from Bacillus sp. WF63 was purified to homogeneity by using annonium sulfate precipitation, Sephaery1 S200 gel filtration and CM Sephrose Fast Flow ion exchange chromatography. This purification protocol resulted in a 9.45 fold purification of lipase with 4.27% final yield, and the relative molecular weight of the enzyme was determined to be 32kw by SDS PAGE approximately. The optimum pH of the lipase was 8.0 and the optimum temperature was 50℃. The lipase was highly stable in the pH range from 4 to 10. K＋and Mg2＋ stimulated lipolytic activity, Na＋,Mn2＋,Ca2＋stimulated lipolytic activity, whereas, Fe2＋ caused inhibition. Triton X-100 stimulated lipolytic activity, Brij 35,Tween-80 stimulated lipolytic activity, whereas, SDS caused inhibition under 1% surfactant.

Key words: Bacillus sp.; lipase; purification; characterization

[HJ2.2mm]

脂肪酶(Lipase EC 3.1.1.3)是一类水解酶，可催化油脂水解，产生甘油二酯、甘油单酯、脂肪酸和甘油.脂肪酶已广泛应用于食品加工、洗涤剂、造纸、皮革加工等行业，还具有化学选择性和高度的立体异构专一性，近年来在手性药物生产［1］、生物柴油［2］制造等领域的报道较多.微生物脂肪酶资源丰富，具有在有机溶剂中稳定性好、广泛的底物特异性、高度的选择性［3］等特点.目前，生产商使用的脂肪酶大多数来源于微生物，属常温酶，高温下反应受限制［4］.

芽孢杆菌产生的脂肪酶具有耐热、抗碱等特点，可在有机相中催化各种反应［5］，应用潜力大.本课题组从土壤中分离并筛选到1株细菌，经研究鉴定为芽孢杆菌，编号WF63.国内对芽孢杆菌产生的脂肪酶报道较少.本文对芽孢杆菌WF产生的脂肪酶的分离纯化方法进行研究，并探讨其酶学性质，为其进一步应用奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

芽孢杆菌（Bacillus sp.） WF63：由本实验室分离、筛选并保存.

1.1.2 试剂

橄榄油、PVA 124、硫酸铵、Tween-80等试剂购自中国医药（集团）上海化学试剂公司； Triton X-100 、Brij 35购自AMRESCO；Sephacryl S-200凝胶、CM Sepharose FF凝胶购自Pharmacia；其他普通试剂均为国产分析纯试剂.

1.1.3 仪器

Pharmacia低压液相层析系统；Beckman冷冻离心机；Ultrospec 2000可见-紫外分光光度计等.

1.1.4 培养基

种子培养基（g/l）：葡萄糖10, 牛肉浸膏2 ，蛋白胨5，酵母浸膏1，pH 7.2；

发酵培养基（g/l）：麦芽糖12,牛肉浸膏3，蛋白胨5，K2HPO40.5，橄榄油乳化液1%(V/V)，pH 7.5.

1.2 方法

1.2.1 WF63脂肪酶的发酵

挑取斜面活化菌种接入装有20mL种子培养液的250mL三角瓶中，30℃、220r/min培养24h，种子培养液按5%接种量接种于装有25mL发酵培养基的250mL三角瓶中，30℃、200r/min培养50h达到产酶高峰.

1.2.2 WF63脂肪酶的硫铵沉淀

收集发酵液，4℃下10000r/min离心10min，获得上清液.按10%~70%的饱和度在上清液中不断搅拌添加硫酸铵，置于低温（4℃）盐析过夜，冷冻离心后取沉淀，即得粗酶.

1.2.3 Sephacry1 S200柱层析

将硫酸铵沉淀获得的粗酶，用pH 9.0 ，0.05mol/L Gly-NaOH缓冲液重新溶解，8000r/min， ４℃离心10min，取上清液，以pH 9.0 Gly-NaOH缓冲液，流速为1.2mL/min上柱，收集具脂肪酶活性的区段.

1.2.4 CM Sepharose FF柱层析

将上一步纯化得到酶液，在pH 7.0， 0.02mol/L磷酸缓冲液充分平衡的CM Sepharose FF层析柱上，再分别用pH 7.0含0.4mol/L NaCl、1mol/L NaCl的磷酸缓冲液进行阶段洗脱，流速为0.8mL/min，收集有脂肪酶活性的区段.

1.2.5 酶活测定方法

滴定法参照文献［6］的方法.酶活定义：在37℃，pH 9.0的条件下，每分钟水解脂肪分解产生1μmol的游离脂肪酸所需要的酶量定义为1个脂肪酶活力单位.

1.2.6 可溶性蛋白测定

以牛血清白蛋白为标准蛋白，采用文献［7］方法进行测定.

1.2.7 脂肪酶分子量

脂肪酶分子量测定采用文献［8］方法.浓缩胶浓度为3%，分离胶浓度为15%.

2 结果与分析

2.1 酶的纯化

分别测定芽孢杆菌WF63脂肪酶发酵液、硫铵沉淀液、分子筛层析液和离子交换层析液的总蛋白和酶活力，计算该脂肪酶每步实验的总酶活、比酶活、纯化倍数和回收率，比较每步纯化的效果，结果见表1.[HJ]

由表1可看出芽孢杆菌WF63脂肪酶发酵液经过离心去菌体，上清液60%硫酸铵沉淀、Sephaery1 S200柱层析、CM Sephrose FF柱层析，被纯化了9.45倍，活性回收率为4.27 %.硫酸铵沉淀总酶活力损失较小，而蛋白质总量变化较大，可见杂蛋白的去处效果较好.对纯化后的脂肪酶进行SDS-PAGE凝胶电泳.

图1中的1

由上至下分别为6种标准蛋白：兔磷酸化酶B（97 400）；牛血清白蛋白（66 200）；兔肌动蛋白（43 000）；牛碳酸酐酶（31 000）；胰蛋白抑制剂（20 100）；鸡蛋清溶菌酶（14 400）,2为对照标准蛋白，计算相对分子量.

由图1可知， SDS-PAGE 凝胶电泳纯化后的脂肪酶为单一条带, 其相对泳动率与分子量对数呈现很好的线性关系，估计该酶的分子量约为32ku左右.

2.2 酶学特性研究

2.2.1 芽孢杆菌WF63脂肪酶的最适温度和温度稳定性

在25～65℃下分别测定脂肪酶活力，取等量的脂肪酶分别置于30～60℃下保温，30min后测定残余酶活，结果见图2.

由图2可知，该脂肪酶在25～65℃都保持一定的活力，最适温度为55℃.说明该酶的最适温度在中温范围；该酶在30～60℃保持较高的活性（残余相对酶活在75%以上），说明该酶可在较宽的温度范围内作用.

2.2.2 芽孢杆菌WF63脂肪酶的最适pH和pH稳定性

在测定酶活的反应体系中加入不同的缓冲液，测定脂肪酶的酶活.酶液分别与一定量的缓冲液（pH4～11范围）混合，放置在室温（25℃）下6h，取出后在40℃测定残余酶活，结果见图3.

由图3可知，在pH4～8的范围内，该脂肪酶的相对酶活随着pH增加而增加，在pH8.0最高，而后随着pH增加而下降，最适pH为8.0；在pH4～10的范围内，该酶残余相对酶活在60%以上，说明该酶pH稳定性较好.

2.2.3 不同金属离子对芽孢杆菌WF63脂肪酶活力的影响

将含有不同金属离子的盐溶液与一定酶液混合，终浓度为5mmol/L，同时以不加金属离子的酶液作为对照，测定不同离子对脂肪酶活力的影响，结果见图4.

由图4可知， K＋，Mg2＋对该脂肪酶活力有一定的促进作用；Na＋，Mn2＋，Ca2＋对该脂肪酶活力影响不大；Fe2＋对酶活的抑制作用不明显；Ag＋，Cu2＋等属于重金属离子，抑制作用明显.

2.2.4 不同表面活性剂对芽孢杆菌WF63脂肪酶活力的影响

将不同浓度（0.1%，0.5%）的非离子型表面活性剂溶液与一定酶液混合20min，同时以不加表面活性剂的酶液作为对照，测定不同表面活性剂对脂肪酶活力的影响，结果见图5.

由图5可知，当浓度为0.1%时，非离子型表面活性剂对脂肪酶有活化作用，尤其是Triton X-100对脂肪酶活力有明显促进作用；Brij35、Tween-80对酶活力的影响不明显；离子型表面活性剂SDS则表现出抑制作用.当表面活性剂的浓度达到0.5%时，非离子型表面活性剂和离子型表面活性剂对脂肪酶活力都表现出不同程度的抑制作用.

3 结论

1）芽孢杆菌WF63脂肪酶发酵液经过离心去菌体，上清液60%硫酸铵沉淀、Sephaery1 S200柱层析、CM Sephrose FF柱层析，被纯化了9.45倍，活性回收率为4.27%.硫铵沉淀纯化后总酶活力损失较小，Sephaery1 S200柱层析酶活损失较大.脂肪酶在SDS-PAGE凝胶电泳图上为单一条带，该酶的分子量约为32ku左右.

2）水解橄榄油实验，说明该脂肪酶酶的最适温度为50℃，最适pH为8.0，在60℃以下和pH4~10之间有良好的稳定性，说明该酶为中温脂肪酶.

3）离子对该脂肪酶的稳定性实验表明：Ca2＋对该脂肪酶活力影响不大，这与有关Ca2＋对脂肪酶有激活作用［9］的报道不同.非离子性表面活性剂Triton X-100对脂肪酶活力有明显促进作用，而Tween-80对酶活没有明显的促进作用与报道［10］不同.

4）该酶表现的特性和传统的微生物脂肪酶有明显的不同，在研究和应用上潜在应用价值，今后可进一步深入探讨.

参考文献:

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