产甘露聚糖酶解淀粉芽孢杆菌的筛选鉴定及产酶条件优化

摘要：从海底淤泥中筛选出一株产高活性β-甘露聚糖酶的菌株，经16S rDNA序列分析表明，该序列与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的16S rDNA序列同源性为100%，将该菌株命名为Bacillus amyloliquefaciens T27。对该菌株产酶条件进行了优化，以魔芋粉为碳源，酵母粉为氮源，装液量为50 mL，250 r/min、37 ℃培养24 h，发酵液中粗酶活力能达到98.0 U/mL。

关键词：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）；甘露聚糖；甘露聚糖酶

中图分类号：TQ925+.9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）13-3105-04

目前，在全球能源危机、粮食缺乏及环境保护越发重要的情况下，甘露聚糖酶在食品、造纸、印染、纺织等许多方面都具有重要作用[1-4]。β-甘露聚糖酶能特异性水解甘露糖类半纤维素，产生大量甘露寡糖和少量甘露糖[5]。该酶广泛存在于植物、动物、微生物中[6]，其中微生物来源的甘露聚糖酶具有易于大规模生产、来源稳定、生产成本低等特点，因此，寻找发掘能够产甘露聚糖酶的微生物资源备受人们关注。由于工业生产中要求所使用的甘露聚糖酶具有较强的稳定性、耐热性及耐酸碱等特性，普通土壤环境下微生物产生的酶很难满足这一要求。海洋尤其深海环境特殊，包括了高压、低温、高盐、极端pH等，这一特殊环境中蕴藏着大量的稀有微生物资源。由于深海微生物产生的酶往往具有耐高温、耐高压和耐盐碱等特点[7]，在一些较为苛刻的工业环境中表现出极大的应用价值。因此，从海洋微生物中发掘新的酶资源受到越来越多的关注。

本研究从海底淤泥中筛选到一株产甘露聚糖酶的海洋细菌，经分子生物学鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），并初步研究了该菌株的最佳产酶条件，为进一步利用该海洋菌株生产甘露聚糖酶奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品与试剂 海底淤泥样品取自厦门深海；Taq DNA聚合酶、PCR试剂、DNA Marker等均购自宝生物工程（大连）有限公司；槐豆胶、低熔点琼脂、蛋白胨和酵母粉购自英国Oxoid公司；UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.1.2 培养基

1）选择培养基。魔芋粉20.0 g，酵母膏20.0 g，NaCl 6.0 g， MgSO4·7H2O 1.0 g， KH2PO4 1.0 g，（NH4）2SO4 2.0 g，蒸馏水1 000.0 mL，pH 7.5。

2）种子培养基（LB培养基）。蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，酵母膏5.0 g，蒸馏水1 000.0 mL，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 产甘露聚糖酶菌株的筛选与鉴定 取约2 g泥样加入到100 mL蒸馏水中浸泡2 h左右， 取适量泥样悬液稀释， 不同浓度梯度分别涂布在固体选择培养基上， 37 ℃倒置培养2 d后，用0.1%刚果红染色10 min后弃去染液，用蒸馏水洗脱，选出透明圈直径与菌落直径比值大的菌株[8]。将筛选出的甘露聚糖酶高产菌株在LB固体培养基上划线培养，挑取单菌落于LB液体培养基中，28 ℃培养12～16 h，提取细菌基因组DNA。以基因组DNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物（fP1：5′-AGAGTTTGAT

CCTGGCTCAG-3′，rP2：5′-ACGGCTACCTTGTTACG

ACTT-3′），PCR扩增所筛选出菌株的16S rDNA， PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸100 s，30个循环；72 ℃延伸7 min。将测序（测序交由华大基因公司完成）后的序列通过与GenBank中登录的基因序列进行BLAST比对，确定筛选出的菌株的种属。

1.2.2 甘露聚糖酶的活力测定 采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定还原糖含量[9]。取10 μL甘露聚糖酶加入到90 μL 0.5%槐豆胶底物，55 ℃反应30 min，然后加入100 μL DNS终止反应，沸水浴10 min，冷却后加蒸馏水定容至1 mL，再取200 μL加至96孔板中，测定OD540 nm。

1.2.3 产甘露聚糖酶菌株产酶条件的优化 ①培养时间对产酶的影响。250 mL三角瓶装入50 mL液体选择培养基，接种2%的种子培养液，置于37 ℃的摇床，转速为250 r/min培养12、24、48 h取样测定酶活。②培养温度对产酶的影响。250 mL三角瓶装入50 mL液体选择培养基，接种2%的种子培养液，置于28、37 ℃的摇床，转速为200 r/min培养24 h后取样测定酶活。③碳源对产酶的影响。250 mL三角瓶装入50 mL以魔芋粉和槐豆胶为不同碳源的液体选择培养基，分别接种2%的种子培养液，置于37 ℃的摇床，转速为250 r/min培养24 h后取样测定酶活。④氮源对产酶的影响。250 mL三角瓶装入50 mL以蛋白胨、酵母粉和（NH4）2SO4为不同氮源的培养基，分别接种2%的种子培养液，置于37 ℃的摇床，转速为250 r/min培养24 h后取样测定酶活。⑤培养基装液量对产酶的影响。250 mL的三角瓶中装入25、50、75、100 mL的液体选择培养基，置于37 ℃的摇床，转速为250 r/min培养24 h后取样测定酶活。

2 结果与分析

2.1 产甘露聚糖酶菌株的筛选

利用选择培养基从海底淤泥样品中筛选高产甘露聚糖酶的菌株。结果发现一株菌落形态光滑的海洋细菌，出现较大、较清晰的水解圈（图1）。

2.2 产甘露聚糖酶菌株的鉴定

LB液体培养基培养细菌过夜后，抽提细菌的基因组DNA。以基因组DNA为模板，利用16S rRNA通用引物PCR扩增16S rDNA，结果见图2。由图2可知，扩增的16S rRNA条带清晰、特异，将回收的16S rDN段送至华大基因公司测序。与GenBank中登录的基因序列进行BLAST比对，结果发现与解淀粉芽孢杆菌的16S rRNA同源性为100%。根据基于近缘种的16S rDNA序列构建的系统发育树，该菌株与DSM11031和B-23049（T）形成一个分支，有100的自展值（图3）。将该菌株命名为Bacillus amyloliquefaciens T27。

2.3 培养时间对产酶的影响

利用以魔芋粉作为选择培养基的惟一碳源，接种2%的种子培养液，置于37 ℃的摇床，转速为250 r/min培养12、24、36、48 h后取样测定酶活，研究培养时间对产酶的影响（图4）。由图4可知，24 h内甘露聚糖酶活力随培养时间的延长呈现上升趋势，并在24 h达到最高点；24 h后甘露聚糖酶活力缓慢下降。这与菌株的生长速率以及酶的表达量、失活速率是基本一致的。

2.4 培养温度对产酶的影响

利用以魔芋粉作为选择培养基的惟一碳源，接种2%的种子培养液，置于28、37 ℃的摇床，转速为250 r/min培养24 h后取样测定酶活，研究培养温度对产酶的影响（图5）。由图5可知，37 ℃培养条件下甘露糖聚酶活力比28 ℃时高出大约20%，37 ℃培养温度对菌株产酶更有利。

2.5 碳源对产酶的影响

天然菌株通常为诱导产酶，不同的碳源由于其化学结构的不同，对菌株的诱导产酶也不同。250 mL三角瓶分别装入50 mL以魔芋粉和槐豆胶为不同碳源的选择培养基，置于37 ℃的摇床，转速为250 r/min培养24 h后取样测定酶活（表1）。从表1中可以看出，菌株在以魔芋粉作为惟一碳源时，产酶效果明显优于槐豆胶。

2.6 氮源对产酶的影响

氮源对发酵产酶有重要影响。250 mL三角瓶分别装入50 mL以蛋白胨、酵母粉和（NH4）2SO4为不同氮源的培养基，分别接种2%的种子培养液，置于37 ℃的摇床，转速为250 r/min培养24 h后取样测定酶活（表2）。从表2中可以看出，菌株在以酵母粉作为惟一氮源时，产酶效果明显优于其他氮源。

2.7 培养基装液量对产酶的影响

培养基装液量直接影响摇瓶发酵中细菌生长的氧气量，从而影响发酵过程中菌株的生长和产酶能力。250 mL的三角瓶中装入25、50、75、100 mL的液体培养基，置于37 ℃的摇床，转速为250 r/min培养24 h后取样测定酶活（图6），由图6可知，50 mL培养基装液量产酶活性最高，达到98.0 U/mL，培养基中氧气含量直接影响解淀粉芽孢杆菌T27的产酶量。

3 小结与讨论

甘露聚糖酶在生物能源、饲料和食品工业中有着广泛的应用，甘露聚糖酶的发酵优化和重组表达能够为工业生产这类酶提供参考。通过透明圈法筛选得到了能够水解甘露聚糖的海洋细菌菌株，其中解淀粉芽孢杆菌T27在甘露聚糖平板上能够显示出相对较大的水解圈，而且相对于其他海洋细菌的水解圈，解淀粉芽孢杆T27水解圈透明度较高。

解淀粉芽孢杆菌T27在以魔芋粉为碳源，酵母粉为氮源，蛋白胨为蛋白水解物，（NH4）2SO4为无机氮源的培养基上产酶效果最好。魔芋粉的主要成分为葡甘露聚糖，而葡甘露聚糖是天然的甘露聚糖以β-1，4-D-吡喃甘露糖苷键连结而成的线状多糖，加上部分葡萄糖残基形成的[10]。槐豆胶主要为半乳甘露聚糖，主要是以β-1，4-D-吡喃甘露糖苷键连结而成的线状多糖，加上部分修饰的半乳糖残基形成[11]。这表明解淀粉芽孢杆菌T27甘露聚糖酶在葡甘露聚糖的诱导下表达好，可能与甘露聚糖酶的水解特性和甘露聚糖酶基因的启动子的特异性有关。不同的氮源，其氮元素的配比和含量上都有明显的区别，这在甘露聚糖的表达诱导上能发挥主要作用。解淀粉芽孢杆菌T27培养24 h产酶活性最高，这与芽孢杆菌的生长特性以及甘露聚糖酶的表达特性有关。培养基的装液量主要影响容氧量。当装液量过高时，容氧量过低，会影响菌体生长，从而影响产酶；当装液量过低时，摇床转动时会产生过大的机械剪切力，使菌体难以与营养成分粘附，导致产酶降低。

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