乳杆菌对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌特性研究

摘 要：本实验以从内蒙古地区传统谷物发酵食品—酸粥中分离并鉴定的13株乳杆菌作为研究对象，研究其对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌能力及抑菌特性。结果表明，13株自酸粥中分离的乳杆菌对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均有不同程度的抑制作用。

关键字：乳杆菌；大肠杆菌；枯草芽孢杆菌；抑菌特性

1. 引言

1.1乳酸菌在食品中的应用

乳酸菌可做发酵剂，是一种或几种固有功能特性的发酵剂，其在感官、技术、营养或健康方面的各种优势使之在食品发酵工业中的应用潜力巨大。它可用于食品防腐、提高食品安全性,改善食品质构和风味,加速奶酪成熟，可产生功能因子、去除毒副因子从而使食品具有保健功效。某些抗噬菌体发酵剂还可解决乳品工业中的噬菌体污染问题。通过基因工程或菌株筛选可以获得所需的功能性发酵剂,它使人们可以更好地控制发酵过程,为消费者提供新型健康食品，此外还有利于食品企业的多样化生产。

1.2乳酸菌抑菌作用的研究

乳酸菌是一种在食品发酵工业中广泛应用的益生菌。它可以抑制或杀死一些病原菌和食物腐败菌，有利于人的健康。近几年的研究表明有些乳酸菌均能分泌产生一种或多种抑菌物质，其中由核糖体合成的一类称为细菌素的具有抑菌活性的多肽或前体多肽，因其具有高效、无毒、无残留、无抗药性等优点已成为生物食品防腐研究的重点，同时被认为是抗生素最有效的替代物。乳酸杆菌产生的乳酸、过氧化氢，也有抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌作用。自乳酸乳球菌产生的细菌素nisin获准作为安全性高的食品防腐剂以来，细菌素的研究已成为微生物学研究中一个活跃的领域。

1.3大肠杆菌及枯草芽孢杆菌的致病性

肠埃希氏菌(E. coli)通常称为大肠杆菌，是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜（禽），常引起严重腹泻和败血症，它是一种普通的原核生物，根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类：致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。

枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用；枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑制其他治病菌生长。

1.4本研究课题的目的与意义

本实验旨在研究从酸粥样品中分离鉴定出的13株乳酸菌分别对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌能力及抑菌特性进行研究。为发现优良菌株，开发生物抑菌物质奠定基础[13]。

2. 试验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌种

样品源自酸粥中分离出的13株乳酸菌，分别为C1、C2、C3、C4、B 、B′、B2 、B a 、A3 、2号 、3号 、5号 、6号。

指示菌：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌标准菌株由内蒙古农业大学微生物实验室保存。

2.1.2 培养基

2.1.2.1 乳杆菌培养基

MRS液体培养基：大豆蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖20 g/L、柠檬酸钠2 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、乙酸钠5 g/L、Tween 80 1 g/L、硫酸镁200 mg/L、硫酸锰54 mg/L，pH 值6.5，121℃ 15min灭菌。

MRS固体培养基：配方同上，添加2%琼脂。

脱脂乳培养基：脱脂乳粉100 g/L、酵母提取粉10 g/L，105℃ 10min灭菌。

2.1.2.2 指示菌培养基

营养肉汤培养基：大豆蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、氯化钠5 g/L，121℃ 15min灭菌。

2.1.2.3 抑菌活性检测培养基

水琼脂培养基：琼脂粉12g/L，121℃ 15min灭菌。营养琼脂培养基，同上。

2.2 方法

2.2.1 乳杆菌代谢产物的制备

将半固体保存的菌株接种到脱脂乳培养基中活化一代（37℃，以有凝乳现象出现为判断标准），然后接种到MRS液体培养基内传两代培养，如此传到第三代。将第三酵液离心（4000r/min，15min），取上清液，经细菌过滤器（0.45um）过滤，收集滤液即为各菌株的代谢产物。

2.2.2 指示菌浓度对抑菌活性的影响

将指示菌菌种接种于对应的最适培养基中，37℃下于培养18h，离心（4000r/min，15min），弃上清液，沉淀用0.85%的灭菌生理盐水清洗，用快速混匀器混匀后再离心，如此离心三次，将沉淀的菌泥用0.85%的灭菌生理盐水振起即得到供试菌悬液，并用灭菌生理盐水调至不同浓度梯度。平板活菌计数法计数，取抑菌圈最明显时的指示菌生长量作为指示菌菌悬液的最佳浓度。

2.2.3 抑菌活性的测定

牛津杯检测法测定代谢产物的抑菌能力参考文献，在培养皿中加入20mL灭菌营养琼脂培养基，待凝固后用灭菌吸管分别吸取0.4mL致病菌液涂布于培养皿中，在每个培养皿内等距离放置牛津杯3个，每个牛津杯加入200 μL待测液体，室温扩散5～8小时，然后37℃恒温培养24小时，观察在牛津杯周围是否有明显的抑菌圈并测抑菌圈的直径。以上试验过程重复2次，结果取平均值。

2.2.4 发酵液的抑菌效果的测定

将半固体保存的菌株接种到脱脂乳培养基中活化一代（37℃，以有凝乳现象出现为判断标准），然后接种到MRS液体培养基内传两代培养，如此传到第三代。用牛津杯法测定发酵液的抑菌活性。

2.2.5 代谢产物抑菌效果的测定

将活化后的乳杆菌的第三酵液离心（4000r/min，15min），取上清液，经细菌过滤器过滤。用牛津杯法测定代谢产物的抑菌活性。

3 结果与讨论

3.1 指示菌浓度的确定

将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌在最适培养基中培养18h后做活菌计数，测定不同浓度梯度下的抑菌效果。实验结果见表1、表2。

表1

表2 指示菌浓度对抑菌效果的影响

注:“—”表示抑菌直径不清楚；“+”表示抑菌直径较清楚；“++”表示抑菌直径很清楚

由上表可知，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌培养18h后活菌数均可达到108 cfu/mL。

4 结论

13株自酸粥中分离的乳杆菌对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均有不同程度的抑制作用。实验结果表明，乳杆菌株C3和B’代谢产物对大肠杆菌的抑菌活性最强，抑菌圈直径分别可达到24.38mm和24.12 mm，而B2和2号对其抑菌活性较弱；对枯草芽孢杆菌抑菌活性最强的是B’和5号，抑菌圈直径分别可达到26.1mm和22.45mm，而B和2号对枯草芽孢杆菌作用较弱。

参考文献

1 谷超，王之锐，魏俊飞，细菌裂解物的免疫调节作用[J]，天津医科大学学报，2004,10（2）：179

2 李铁军，李爱云，张晓锋，乳酸菌抗菌机理研究进展[J]，微生物学通报，2002,29 （5）：81-85