食品大肠菌群检测应注意的问题

摘要：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，称为大肠菌群，包括埃希氏菌属，克雷伯氏菌属、肠杆菌属和柠檬酸杆菌属等的细菌。因为检验比较简单，所以被广泛用做水源的卫生指标和食品加工卫生状况的通用指标。通常以大肠菌群MPN计数法和平板计数法进行检测。本文根据工作经验从提高大肠菌群检测的准确性，进行质量控制应注意的问题做一介绍。

关键词：食品大肠菌群 检测 问题

1 采样应注意的问题

采样应有无菌操作的概念，在无菌操作下进行，并尽快的送到检验室，途中应注意对样品的保护，因为大肠菌群繁殖快，所以送检时间与检验开始时间之间越短越好，途中可通过低温坏境保存来减少大肠菌群的菌数增加。

2 检验前实验室应注意的问题。

2.1 温度计的控制

实验室应具有工作温度计和参照温度计，一般可半年进行一次温度计的运行检查。

2.2 培养箱和冰箱的温度控制

一般情况下示值与实测值相差不大于±1℃。可将工作温度计置于甘油中，放入待测箱体，观察温度计温度，做好1～2次/天的监控记录。

2.3 高压灭菌锅的控制

生物示菌法、化学变色纸片及高压灭菌锅温度计等方法检测，生物指示剂是一种高压灭菌锅的效果指示法。高压灭菌锅使用时内置物品不能太多，应注意内容物的不同耐受温度，总的暴露时间最好不超过45分钟。

2.4 紫外灯的控制

仪器测试法和生物测试法，前者通过专用仪器检测紫外光强度，在距离照射1米处要求强度为90:；生物测试法，采用一定的菌悬液，控制在约500个／ml，涂布平板在紫外灯下照射2min。同时设置普通光源组对照，后37℃培养48h，计算其杀灭率，要求达99%。

2.5 培养基的质量控制

对新批号的的干燥培养基物理、化学、生物指标的鉴定。（1）感官研细程度和颜色、透明度、杂质等。（2）PH测定，按各种培养基要求的PH±0.2。（3）生物学指标检定，被检培养基相应细菌生长率测试，菌落大小及特征的检测。

生长率测试，适用于液体和固体培养基。取合适稀释度的菌悬液平板计数或接种被检的培养基试管，同时以按相关的培养基国标配方新鲜配制的培养基进行对照，不低于10%。

菌落大小测试，划线分离测试菌，取10个菌落测量直径大小，其直径均值与新鲜配制培养基无统计学差异。

培养基的保存环境，制成的培养基保存环境为0～4℃冰箱，如制成平板用塑料袋包装置冰箱保存，有的培养基如含有高浓度胆盐的培养基以存放温度10～15℃为宜。

3 检验过程中应注意的问题

3.1 样品的稀释

对于固体和半固体样品，标准给出了两种均质方式。即：用旋转式均质器或拍打式或叫蠕动式均质器均质。很多都喜欢用拍打式均质器。不过，请注意，有些样品是不能使用拍打式均质器的，如一些具有穿刺风险的样品（带刺的样品，鱼），还有一些由于自身质地特殊难以均质的样品，像腌制香肠；另一个值得注意的是，对于冷冻的固体样品，检验前的解冻。一般是建议 2℃～5℃解冻,时间不超过18h，或在不超过45℃的温度中解冻，时间不超过15min。冷冻样品不必完全融化，只要软化到能够取样和制样就可以了。比如，如果将一块冻肉化得血水都流出来了，再去制样和检验，结果的准确性可能会有些影响。

样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时要进行调节，如有些果汁pH值很低，如果不进行调节，检验结果的误差可能就会比较大。

3.2 MPN计数法

在所有MPN法的ISO标准里都提醒检验者，MPN法的结果可能会存在较大差异，应谨慎使用通过该法所获得的结果数据。所以说原标准 MPN表中一些数字别说不可能出现，就算是出现了，也是不可接受的结果。检验者应该对检验过程进行分析，是不是样品过酸或过碱、是不是含有抑菌物质，操作是否有误等等。

新标准要求选择适宜的三个连续稀释度的样品均液，接种LST肉汤。对有些样品还是比较容易确定的，但有些样品就不太容易确定了，为了检测的准确性，在实际工作中可能选择多于3个的连续稀释度，4个或者5个，一般选择最后一个低稀释度（最高稀释度）为3管产气的记为第一稀释度。一般情况下，固体样品选作1g×3、0.1g×3、0.01g×3；液体样品选作10mL×3、1mL×3、0.1mL×3。

在接种BGLB肉汤证实实验时，接种环每次使用前后均应火焰彻底灭菌, 但接种时一定要注意冷却, 否则本应检出的样品可能发出未检出的报告。

3.3平板计数法

平板计数法相对于MPN法来说，检验结果更精确，适合用于污染比较严重的样品，但对于污染菌量太少的样品，还是MPN法更有优势。新的食品安全标准中常见乳品的大肠菌群均要求使用平板计数法检测。

接种样液后，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，应该再加3 mL~4 mLVRBA覆盖平板表层，可有效的预防由变形杆菌等其他菌群造成的平板菌落蔓延。

计数平板上出现的典型大肠菌群菌落为紫红色，菌落周围有胆盐与酸形成的沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。标准要求从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，移种于BGLB肉汤管内，进行证实实验。以下情况应该必须作证实实验：一是非典型菌落，如在颜色、直径方面与典型菌落不符合的菌落；另一种情况是被检样品中含有乳糖以外的其他糖类，如牛奶、饮料等样品。大肠菌群的定义是发酵乳糖，但由于样品含有的其他糖类混入了培养基，使得不能分解乳糖但能分解其他糖类的菌类也能够长出红色菌落，所以证实实验必要。

发酵管倒管内的产气量

LST中的选择性抑菌剂是月桂基硫酸盐，所以管底不产生沉淀，便于观察，BGLB由于配方里有胆盐，胆盐遇到大肠菌群分解乳糖所产生的酸而形成胆酸沉淀，所以比较浑浊，而且也可以看到管底的沉淀。 在实际工作中, 大肠菌群的产气量, 多者可以使倒管全部充满气体, 少者可以产生小于米粒的气泡。一般来说, 产气量与大肠菌群检出率成正相关, 但随样品种类而有所不同。有小于米粒的气泡, 也可有阳性检出。根据大量工作实践，对未产气的发酵管是否按阴性处理, 应慎重考虑。在日常工作中, 经常可以遇到，有时倒管内虽无气体, 但在液面及管壁却可以看到缓缓上浮的小气泡。所以对未产气的发酵管如有可疑时, 可用手轻轻打动试管, 如有气泡沿管壁上浮, 考虑可能有气体产生,应作进一步观察。这种情况的阳性检出率可达半数以上。