低分子肝素对抗心磷脂抗体阳性血清中JAR细胞增殖能力的影响

[摘要] 目的 研究子痫前期孕妇抗心磷脂抗体（ACA）阳性血清对JAR细胞生长周期和增殖能力的影响，以及低分子肝素对该细胞生长的调节。 方法 JAR细胞按如下3组培养：对照组添加健康妊娠妇女血清；处理1组添加ACA阳性的子痫前期孕妇血清；处理2组添加抗ACA阳性的子痫前期孕妇血清及低分子肝素。采用MTT 法检测细胞的增殖能力，以490 nm处的平均吸光度（OD值）表示；采用流式细胞仪检测细胞生长周期。 结果 正常对照组的OD值为0.460±0.069，处理1组的OD值为0.310±0.058，与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）；处理2组的OD值为0.410±0.076，与对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。流式检测结果显示，正常对照组S期细胞占（27.27±3.73）%，处理1组的S期细胞比例[（18.12±3.75）%]下降，与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；而处理2组的S期细胞为（24.67±4.66）%，与对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 体外实验表明，ACA对可以调节JAR细胞的生长周期，抑制其增殖能力，而低分子肝素能逆转抗体的这种作用。

[关键词] 抗心磷脂抗体；低分子肝素；JAR细胞；增殖

[中图分类号] R973+.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）07（a）-0011-03

Effects of low molecular weight heparin on the proliferation of JAR cells cultured with anticardiolipin antibody positive serum

WU Xiao-xia1 YANG Hong1 CHEN Fang1 HUANG He-ming2 WANG Chen-hong1

1.Department of Obstetrics，Maternity and Child Health Care Hospital of Shenzhen City，Guangdong Province，Shenzhen 518028，China；2.Department of Gerontology，People's Hospital of Shenzhen City，Guangdong Province，Shenzhen 518020，China

[Abstract] Objective To investigate the effects of anticardiolipin antibody （ACA） positive serum from patients with preeclampsia on the proliferation of JAR cells，and the effect of low molecular weight heparin （LMWH） on the proliferation of JAR cells cultured with ACA positive serum. Methods JAR cell cultured according to the following three groups：the control group add healthy pregnant women serum；Treatment 1 group add anti cardiolipin antibody positive of preeclampsia in pregnant women serum；Treatment 2 group add ACA positive preeclampsia in pregnant women serum resistance and low molecular heparin.Determined by MTT method was used to detect cell proliferation，at 490 nm in the average absorbance （OD value）；The cell growth cycle detected by flow cytometry instrument. Results The OD value was 0.460±0.069 in normal control group；The OD value was 0.310±0.058 in treatment 1 group，compared with control group，the difference was significant（P < 0.01）；And the OD value was 0.410±0.076 in treatment 2 group，compared with control group，the difference was not significant （P > 0.05）.The flow tests showed：the ratio of JAR cells in S phase in the control group was （27.27±3.73）%，the ratio of JAR cells in S phase in treatment 1 group was （18.12±3.75）%，compared with control group，the difference was significant （P < 0.05）；And the ratio of JAR cells in S phase in the treatment 2 group was （24.67±4.66）%，compared with control group，the difference was not significant （P > 0.05）. Conclusion ACA can inhibit JAR cell proliferation in vitro， whereas LMWH can reverse the inhibition of ACA on JAR cells.

[Key words] Anticardiolipin antibody；Low molecular weight heparin；JAR cell；Proliferation

子痫前期是引起围生期母儿发病率和死亡率升高的重要原因。近年来的研究发现，子痫前期与血栓前状态密切相关，而抗心磷脂抗体（anticardiolipin antibody，ACA）是其中重要的致病因素[1]。低分子肝素（low molecular weight heparin，LMWH）具有良好的抗凝、抗栓作用，且副作用小、安全性高，近年来在ACA阳性的子痫前期孕妇中得到了大胆应用[2]，且其治疗成功率高。为了探讨其发病机制及药物的作用，本实验以JAR细胞为基础，建立体外培养模型，从实验方面探讨子痫前期孕妇ACA对滋养细胞增殖能力的影响及低分子肝素对ACA的逆转作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂 四甲基偶氮唑盐（华美生物工程公司） ，二甲亚砜（DMSO，国药集团），LMWH（成分为Enoxaparin，商品名“克赛”，赛诺菲安万特公司）。人绒毛膜癌细胞株JAR细胞从上海细胞所购买引进。

1.1.2 主要仪器 荧光显微镜（Olympus）、酶标仪（Bio-Rad 3550）、流式细胞仪（BD公司）。

1.1.3 血清搜集 选择在本院门诊就诊的子痫前期孕妇（参照第七版《妇产科学》关于妊娠期高血压疾病的诊断标准），检测其ACA阳性，空腹抽取肘静脉血5 ml，静置于无菌试管10 min后，3000 r/min离心10 min，取上清，-80℃保存备用。同法取5 ml同孕周的健康妊娠妇女的血清备用。

1.1.4 实验分组 JAR细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液，在37℃、5%CO2培养箱中培养。实验所用JAR细胞按如下3组培养：对照组添加健康妊娠妇女血清；处理1组添加ACA阳性的子痫前期孕妇血清；处理2组添加ACA阳性的子痫前期孕妇血清及LMWH。3组中每次实验所加血清量均为20 μl，LMWH终浓度为0.25 U/ml。

1.2 检测指标

1.2.1 四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法检测细胞增殖情况 JAR细胞生长至对数生长期，0.25%胰酶消化后计数，以5×103细胞接种于96孔板内，按3个分组进行处理、培养，每组设5个复孔。于接种后24 h加入MTT（5 mg/ml）20 μl，37℃孵育4 h，弃净上清液，然后加DMSO 150 μl，振荡10 min，酶标仪检测各孔490 nm处的平均吸光度（OD值）。重复实验3次。

1.2.2 流式细胞术检测细胞周期 滋养细胞接种于6孔板中，按实验分组进行处理培养，24 h后常规胰酶消化制成单细胞悬液，1000 r/min离心5min，弃去上清，PBS清洗1次，离心去PBS，加入预冷的70%乙醇，4℃固定24 h。离心去乙醇，PBS清洗1次，离心弃去。加入0.5 ml 50 μg/ml碘化丙啶（propidium iodide，PI）于避光处染色30 min，直接加PBS 600 μl重悬后用流式细胞仪检测。实验设5复孔，重复实验3次。

1.3 统计学处理

数据采用SPSS 13.0及Excel 2003软件包处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT增殖试验的比较

加入ACA阳性血清的处理1组490 nm处的OD值为0.310±0.058，明显小于正常对照组的0.460±0.069，差异有统计学意义（P < 0.01）。加入LMWH后的处理2组490 nm处的OD值为0.410±0.076，与处理1组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）；而处理2组与正常对照组比较，差异有统计学意义（P > 0.05）（表1）。

2.2 细胞周期试验的比较

正常对照组JAR细胞S期比例为（27.27±3.73）%，处理1组的ACA阳性血清作用后，S期细胞减少，占（18.12±3.75）%。而处理2组的LMWH可以逆转ACA的作用，恢复S期细胞比例为24.67%（表2、图1）。

3 讨论

滋养细胞携带来自胎儿的外胚层抗原，是母-胎界面唯一与母体免疫系统直接接触的胎儿细胞，在母-胎免疫耐受中发挥重要作用。在早孕期间，滋养细胞具有很强的增殖能力，对胚胎的发育非常重要。滋养细胞的增殖一直持续到足月，但其增殖能力随妊娠进展而降低。如果滋养细胞增殖能力异常下降，可导致胚胎发育延缓或迟滞，造成不良妊娠结局，如胎儿宫内生长受限、妊娠期高血压疾病、自然流产等[3-4]。

由于获得胎盘原代滋养细胞比较困难，并且在分离和短期应用后，细胞功能可发生一些潜在的变化，因此，原代滋养细胞在实验中的应用受到了限制。现在常用于滋养细胞功能模型的细胞来源于恶性葡萄胎或绒毛膜癌的细胞，JAR细胞就是其中一种。

在检测细胞生长发育的众多方法中，MTT法具有简便、快速、灵敏等优点。其检测的OD值大小与活细胞数呈正相关，用这种方法能直接、客观反映细胞的增殖状态。而流式细胞技术可以用来检测细胞生长周期。细胞DNA的倍增发生于间期中的合成期（S期），S期之前为G1期，之后为G2期，未进入分裂周期的细胞处于G0期。S期细胞的比例可以作为细胞增殖能力的一个评估指标。

近年来研究发现，ACA阳性在子痫前期的发病中起很重要的作用[5]。其机制可能有：ACA作为自身抗体可通过激活凝血系统而造成高凝状态直接攻击血管内皮细胞而造成血管内皮损伤，使孕妇自身动、静脉痉挛缺血，血栓形成，血管梗塞；同时ACA还通过争夺胎盘血管和血小板膜上的磷脂受体引起血小板凝聚，形成血栓，或与血管内皮磷脂部位结合，损伤血管内皮，使前列环素合成减少，前列环素与血栓素A2比例失常，导致局部血管内血栓形成，从而导致梗塞。但除了对凝血-纤溶系统造成影响外，ACA还可以直接对妊娠滋养细胞产生影响，使其增生、侵袭等能力受到抑制。本研究以JAR细胞株为研究模型，采用MTT试验和流式细胞技术检测细胞的增殖和细胞周期，证实了ACA对滋养细胞的直接抑制作用。本研究发现，在ACA阳性血清的作用下，JAR细胞的生长周期受到干扰、S期细胞比例减少，增殖能力被抑制。这从理论上验证了ACA对滋养细胞的直接作用。

LMWH是由普通肝素经过酶或化学解聚产生的小分子片段产物，由于其生物利用度高、副作用远小于普通肝素，已经作为经典的抗凝、抗栓药物在临床广泛应用，但是由于其具有复杂的结构与组分，生物学活性广，人们越来越多地关注其多元化的功能。LMWH在不良妊娠中的使用显著提高了妊娠成功率，通过研究发现LMWH的作用远超过于抗凝、抗栓，其免疫调节作用不容忽视。LMWH可以抑制自然杀伤（NK）细胞的功能、抑制粒细胞的游走和渗出、抑制补体的激活、调节母-胎界面的细胞因子网络向Th2型优势转化等[6-9]。除此之外，研究发现LMWH对滋养细胞的生物学功能也具有影响[10-12]。2004年，Bose等[10]发现狼疮因子阳性的血液可使滋养细胞的增殖减少、凋亡增加，侵袭能力降低；而在加入25 U/ml的肝素时，可以改善这些抑制作用，增强滋养细胞增殖及侵袭，减少其凋亡。在本实验中，实验组中加入了0.25 U/ml的LMWH（这和药物的体内作用浓度相当），在ACA抑制JAR细胞增殖、并改变其细胞周期的情况下，LMWH的加入则逆转了这种作用。这和我们的临床效果是相符合的。

多个学者研究发现，肝素可以抑制平滑肌细胞的增殖，并提出这种抗增殖作用的机制有[13-14]：①结合并干扰成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）的功能；②抑制细胞周期素依赖型激酶的激活，抑制细胞进入DNA合成期，抑制增殖；③进入细胞内，通过抑制促分裂原活化蛋白激酶（MARK）的激活等多种细胞信号转导途径影响细胞增殖。2006年，Hills等[15]通过研究肝素对滋养细胞凋亡的研究时发现，肝素有类似表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）和肝素结合性表皮生长因子（heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF）的作用，可以引起滋养细胞上的EGF受体磷酸化，通过激活磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）和c-Jun氨基端激酶（JNK）的信号转导途径，起到抗凋亡作用。目前，LMWH影响滋养细胞增殖功能的具体机制尚未明确，但以上研究为医学工作者提供了进一步研究的方向。

综上所述，本研究从JAR细胞的增殖能力着手，研究ACA对滋养细胞增殖能力的影响及LMWH对该细胞生长的调节，证实了自身抗体能够对滋养细胞的生物学行为产生直接的影响进而导致不良妊娠结局的发生；另外，LMWH的成功干预为药物的临床使用提供了理论依据。但对于LMWH体外有效的干预作用，其临床使用还存在很多有待解决的问题。

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（收稿日期：2013-04-10 本文编辑：林利利）