液相色谱-串联质谱法测定牛奶中伏马菌素FB-1和FB-2及其水解代谢物

摘 要 建立了MAX混合阴离子固相萃取柱净化高效液相色谱串联质谱法测定牛奶中伏马菌素FB1和FB2及其水解代谢产物HFB1和HFB2的方法。牛奶样品经水稀释后，经MAX柱直接净化，甲醇洗脱得到FB1和FB2，经液相色谱串联质谱负离子扫描测定，1%乙酸甲醇洗脱得到HFB1和HFB2，经液相色谱串联质谱正离子扫描测定。结果表明，添加浓度为0.l～5.0

SymbolmA@ g/L，牛奶中FB1和FB2及其水解代谢产物的回收率为76.4％～92.3％；相对标准偏差（RSD，n＝5） 为5.9％～12.5％；方法检出限（LOD） 均为0.03

SymbolmA@ g/L；定量限（LOQ） 均为0.1

SymbolmA@ g/L。本方法操作简单，灵敏度、回收率和重复性均良好。

[KH*3/4D][HTH]关键词 [HTSS]牛奶； 伏马菌素； 水解代谢产物； 固相萃取； 液相色谱串联质谱

[HT][HK]

[FQ（3２,X,DY－Ｗ][CD15] 20110711收稿；20111228接受

本文系浙江省分析测试基金（No.省略.

[HT]

1 引 言

伏马菌素（Fumonisin，FB）是一类主要由串珠镰刀菌产生的真菌毒素，其中FB1（C34H59O15N，图1）和FB2（C34H59O14N，图1）是污染食品和饲料的主要成分，也是FB诱发食道癌、肝癌、胃癌等疾病的主要原因。FB在农产品中污染范围较广，在玉米\[1,2\]、

红酒\[3\]、啤酒\[4\]、芦笋\[5\]、牛奶\[6\]等中有不同程度的检出。目前尚未有牛奶中FB限量的规定，欧盟规定婴幼儿玉米制品中FB（含FB1和FB2）的限量为0.2 mg/kg\[7\]，但研究报道低浓度FB与其它毒素如黄曲霉毒素会产生协同毒害作用\[8\]。 FB水解失去碳骨架14和15位的 [TS（][HT5”SS] 图1 FB1（R1＝OH）, FB2（R1＝H）的结构式

Fig．1 The structure of fumonisin B1 （FB1） and FB2[HT][TS）]

[TS（][HT5”SS] 图2 HFB1（R1＝OH）, HFB2（R1＝H）的结构式

Fig．2 The structure of hydrolysed fumonisin B1 （HFB1） and HFB2[HT][TS）]丙三羧酸基团后生成脱丙三羧酸伏马菌素 （Hydrolysed fumonisin B, HFB），HFB1和HFB2（结构式见图2）能抑制神经鞘氨醇的合成\[9\]。Pagliuca等\[10\]测定了猪肝中的FB1和HFB1，Gazzotti等\[11\]测定了猪肝中的FB1, FB2, HFB1和HFB2。尚未见牛奶中FB和HFB同时测定的报道。牛奶消费群体广、数量大，检测其可能含有的FB及其水解代谢物的残留量对评价牛奶安全和保障人体健康有重要意义。

测定农产品或食品中低浓度的FB和HFB，要求方法具有较高灵敏度，前处理一般需要浓缩富集净化。文献报道的前处理技术有免疫柱净化\[6\], HLB\[12\]柱净化、阳离子柱净化\[13\]和阴离子柱净化\[5,14\]，测定方法有酶联免疫法、胶体金法\[15,16\]、经邻苯二甲醛和巯基乙醇衍生后高效液相色谱荧光测定法\[10,13,14\]、液相色谱串联质谱法\[5,6,11,12\]。本实验基于牛奶（pH≈7）中FB1和FB2的羧基发生电离，主要以呈负离子形式存在，HFB1和HFB2以分子形式存在，故采用阴离子反相混合MAX柱子同时净化FB1, FB2和其水解代谢产物，并运用高选择性和高灵敏度的液相色谱串联质谱测定。结果表明，FB1和FB2在串联质谱负离子反应监测模式下背景值低于正离子模式，HFB1和HFB2正离子模式下响应值远高于负离子模式，因此采用负正两种电离模式分别测定伏马菌素和水解代谢物。4种化合物的方法定量限达到 0.1

SymbolmA@ g/L，能满足牛奶中FB1, FB2及其水解产物测定的需要。2 实验部分

2.1 仪器与试剂

液相色谱串联质谱：TSQ Quantum配surveyor液相操作系统（美国Thermo Fisher scientific公司）；Synergi Hydro RP 色谱柱（150 mm×2.0 mm，3

SymbolmA@ m, 美国Phenomenex公司）；Sorvall Primo R高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Nanosep GHP超滤浓缩离心管（0.45

SymbolmA@ m，美国PALL公司）；HLB柱（200 mg，6 mL，美国Waters公司）；MAX柱（150 mg，6 mL，美国Waters公司）。甲醇（色谱纯，美国Merck公司）；甲酸和乙酸（色谱纯，美国Tedia公司）；标准品FB1（＞98%）和FB2（＞98%）购自德国Sigma公司。分别准确称取5.00 mg FB1或FB2, 用甲醇溶解并定容至25 mL，配制成200 mg/L储备液。

HFB1和HFB2的制备：取0.5 mL 200 mg/L的FB1或FB2甲醇溶液，加入10 mL 1 mol/L KOH溶液，70 ℃孵育1 h，冷却至室温，用2 mol/L HCl溶液调节至pH 4.5\[10\]。转移溶液至已用5 mL甲醇和5 mL水依次活化的HLB柱，5 mL水洗后，抽干，5 mL甲醇洗脱，并用甲醇定容至5.0 mL，经液相色谱串联质谱确定无FB1或FB2残留。HFB1和HFB2的浓度分别为11.2和11.0 mg/L，溶液用于质谱条件优化和稀释后用于添加回收实验。

2.2 实验方法

吸取10.0 mL 牛奶于50 mL离心管中，加入10 mL水稀释，转移至已用5 mL甲醇和5 mL水依次活化的MAX柱，5 mL水洗涤、5 mL甲醇洗脱并收集，再用5 mL 1%乙酸甲醇洗脱并收集，氮气吹干后，分别加入200

SymbolmA@ L甲醇0.1%甲酸（75∶25，V/V）混合液，振荡涡旋15 s后转移至超滤浓缩离心管中，以1000 r/min离心3 min后，取滤液进行液相色谱串联质谱分析。

用甲醇配制浓度为0.5和0.05 mg/L的FB1， FB2， HFB1和HFB2混合标准溶液。在空白牛奶中进行4个添加浓度水平的回收实验，每个实验平行5次：10.0 mL牛奶中分别添加0.5 mg/L混合标准溶液20和100

SymbolmA@ L，添加0.05 mg/L混合标准溶液20和100

SymbolmA@ L，静置1 h后按照上述实验方法进行测定。

2.3 色谱质谱条件

色谱柱柱温: 30 ℃; 进样量：20

SymbolmA@ L；流动相：甲醇0.1%甲酸（75∶25，V/V）混合液，流速：0.2 mL/min。

质谱条件：电喷雾负离子扫描，喷雾电压：

Symbolm@@ 3000 V；正离子扫描，喷雾电压：4000 V；毛细管温度：350 ℃；碰撞气氩气：1.5×10

Symbolm@@ 3 torr（11.2×10

Symbolm@@ 6 Pa）。定量和定性离子对、碰撞能量等参数见表l。在此条件下，FB1和FB2保留时间分别为2.9和4.3 min。HFB1和HFB2保留时间分别为3.0和4.1 min。

分 析 化 学第40卷

第5期钱鸣蓉等： 液相色谱串联质谱法测定牛奶中伏马菌素FB1和FB2及其水解代谢物

3 结果与讨论

3.1 质谱条件的选择

液相色谱串联质谱测定伏马菌素一般采用正离子模式\[5,6,11,12\]。本实验采用“T”三通方式，分别在负正离子模式下对FB1, FB2及其水解代谢产物进行质谱条件优化，FB1和FB2浓度均为10 mg/L。正离子模式下，以甲醇0.1%甲酸溶液（50∶50, V/V）为流动相，FB的响应约为1×107，\[M＋H\]＋通过丢失TCA（HOCOCH2 CH（COOH）CH2COOH）和H2O裂解产生碎片\[M＋H－2TCA－H2O\]＋, \[M＋H

Symbolm@@ 2TCA－2H2O\]＋, \[M＋H－TCA－H2O\]＋ \[10\]，FB1主要生成m/z 352， 334和528，FB2主要生成m/z 336, 318和512。负离子模式下，以甲醇水（50∶50, V/V）为流动相，FB1或FB2 的\[M

Symbolm@@ H\]

Symbolm@@ 响应约为2×106，主要由TCA基团与骨架相连的羧基发生断裂产生碎片离子\[OCOCH2CH（COOH）CHCO\]

Symbolm@@ 和\[M－H－HOCOCH2CH（COOH）CHCO\]

Symbolm@@ ，其中FB1裂解生成m/z 157和562，FB2裂解生成m/z 157和546。

本实验在FB1和FB2添加浓度均为0.1

SymbolmA@ g/L的条件下，分别在正负电离模式下进行反应离子监测扫描，分别以响应值最高和次高的离子对用于定量和定性分析，其中正离子模式下FB1的定量与定性离子对分别为m/z 722.4/334， 722.4/352，FB2的定量与定性离子对分别为m/z 706.4/318， 706.4/336。在正离子模式下，背景响应值较高，杂质易对低浓度FB1的定量产生干扰；在负离子模式下，背景响应值远低

[LM][HT5”SS][*4]表1 伏马菌素FB1, FB2和脱丙三羧酸伏马菌素HFB1, HFB2的质谱条件参数

Table 1 LCMS/MS parameters for fumonisin B1, B2and hydrolysed fumonisin B1, B2

[HT6SS][BG（][BHDFG４,WK16，WK8*2。2，WK14，WK10W]名称Name分子量

Molecular weight电离模式Mode定性与定量离子对

Ion pairs for quantification

and confirmation碰撞能量Collision energy（eV）

伏马菌素 B1

Fumonisin B1721.4－720.4/157*

720.4/5623830

伏马菌素 B2

Fumonisin B2705.4－704.4/157*704.4/54638

29

脱丙三羧酸伏马菌素B1

Hydrolysed fumonisin B1405.3＋406.3/388*406.3/37015

14

脱丙三羧酸伏马菌素B2

Hydrolysed fumonisin B2389.3＋390.3/336*390.3/35419

14[BHDFG3,WKZQ0W] *：表示用于定量分析的离子对（Ion pairs with asterisk are used for quantification）。[BG）W][HT][]

于待测物响应值，无明显杂质峰，信噪比高（图3A），因此本实验选择在负离子模式测定牛奶中FB1和FB2。

HFB1和HFB2在负离子模式下无明显响应，在正离子模式下反应离子碎片由\[M＋H\]＋失去1、2或3个H2O生成。正离子模式下，0.1

SymbolmA@ g/L的添加回收的提取离子流色谱图见图3B。

[TS（][HT5”SS]图3 牛奶中添加浓度为0.1

SymbolmA@ g/L，负离子模式下FB1和FB2的提取离子流色谱图（A）, 正离子模式下HFB1和HFB2的提取离子流色谱图（B）

Fig．3 Extraction ion chromatograms of FB1 and FB2 detected in negative mode （A）, HFB1 and HFB2 detected in positive mode （B） spiked at 0.1

SymbolmA@ g/L in milk[HT][TS）]

3.2 净化条件与色谱条件的确定

实验测定市场不同品牌的15个牛奶样品，pH均约为7。FB1和FB2含有2个TCA，为酸性化合物，在牛奶样品中主要以负离子形式存在；HFB1和HFB2不含有羧酸基团，主要以分子形式存在。将牛奶用水稀释后上柱，FB与MAX交换柱上的阳离子基团结合，HFB通过反相作用保留于MAX柱上，水洗涤去除杂质后，用甲醇洗脱HFB，酸化甲醇使FB成分子形态同时被洗脱。

酸性化合物FB1和FB2在水中电离，以甲醇水为流动相时，两种FB在色谱柱上的峰形严重拖尾。在流动相中加酸可抑制FB的电离、改善峰形，但酸浓度过高会抑制FB在负离子模式下的离子化效率、降低灵敏度。本实验分析了甲醇和水相比例为75∶25（V/V），水相中甲酸浓度为0.05%, 0.1%和0.2%时FB的响应值和峰形，当甲酸浓度为0.1%时，峰形对称且响应值较高，背景值较低；含有甲酸的流动相有助于提高HFB在正离子模式下的质子化电离效率。

3.3 基质效应与线性范围

用流动相稀释一系列FB1, FB2, HFB1和HFB2的混合标准溶液，浓度分别为1, 5, 10, 20, 50和100

SymbolmA@ g/L。同时按照2.2节处理空白牛奶样品配制相同浓度的基质混合标准溶液。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，基质标准曲线与溶剂标准曲线的斜率比值可以反应基质干扰作用强弱。由图4可见，FB1, HFB1和HFB2有一定的基质抑制效应，斜率之比分别为0.84, 0.83和0.91，FB2无明显基质干扰作用，为使定量分析更准确，配制基质标准溶液进行定量分析。

[TS（][HT5”SS]图4 FB1（A）, FB2（B）, HFB1（C）和HFB2（D）在溶剂标（■）和牛奶基质标（）中的浓度峰面积线性回归曲线

Fig．4 Linear regression curves for FB1（A），FB2（B），HFB1（C） and HFB2（D） in solvent（■） and milk matrix（）[HT][TS）]

3.4 方法的回收率、精密度和灵敏度

在空白牛奶中添加含FB1, FB2, HFB1和HFB2的混合标准溶液，使其浓度分别为0.1, 0.5, 1.0和5.0

SymbolmA@ g/L，方法回收率和精密度见表2。

在实验色谱质谱条件下，分析平行操作5次、添加浓度为0.1

SymbolmA@ g/L的FB1, FB2, HFB1和HFB2的分子离子峰图谱。分别以噪音信号的3倍和10倍计算方法的检出限和定量限。FB1, FB2, HFB1和HFB2的方法检出限（LOD）为0.03

SymbolmA@ g/L，定量限（LOQ）为0.1

SymbolmA@ g/L。

[KH*4D][HT5”SS][*4]表2 方法添加回收率和精密度（n＝5）

Table 2 Recovery and precision of method（n＝5）

[HT6SS][BG（][BHDFG4,WK7*2,WK12,WK*2,WK12,WK*2,WK12,WK*2,WK12W]添加水平

Fortification

level （

SymbolmA@ g/L）FB1回收率

Recovery （%）RSD

（%）FB2回收率

Recovery （%）RSD

（%）HFB1回收率

Recovery （%）RSD

（%）HFB2回收率

Recovery （%）RSD（%）

0.180.58.478.610.379.46.776.412.5

0.586.57.682.68.4 81.69.385.78.4

191.26.789.27.785.45.982.49.7

588.29.183.59.4 92.37.785.16.8

[BG）Ｗ][HT][]

3.5 实际样品的检测

随机抽取市场上6个不同品牌牛奶15个样本，测定FB1, FB2, HFB1和HFB2含量。在某品牌牛奶中检出FB1，含量为（0.18±0.013）

SymbolmA@ g/L （n＝3），其它未有检出。与文献\[6\]检测出的牛奶样品中FB1平均浓度0.6

SymbolmA@ g/L相当。

本方法能满足牛奶中伏马菌素及其水解代谢物检测的要求，为进一步分析牛奶中真菌毒素的污染水平和安全性评价奠定基础。

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Determination of Fumonisins B1, B2 and Their Hydrolysed Metabolites in

Bovine Milk by Liquid ChromatographyTandem Mass Spectrometry

QIAN MingRong*1, WU LiQin1, ZHANG Hu1, LIU Fei2, LI Rui1, CHEN ZhiMin1, FANG LiZhen1

1（Zhejiang Province Key Lab for Food Safety, Institute of Quality and Standard for Agroproducts,

Zhejiang Academy of Agricultural Sciences; Hangzhou 310021, China）

2（ThermoFisher Scientific （Shanghai）, Shanghai 201206, China）

Abstract MAX column combined with high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry was used to determine fumonisins B1（FB1）, FB2 and their hydrolysed metabolites in bovine milk. After 10 mL milk was diluted with 10 mL water, it was directly transferred to MAX column for purification. FB1 and FB2 were eluted with methanol and detected with HPLCMS/MS in negative mode. The hydrolysed metabolites hydrolysed fumonisins B1（HFB1） and HFB2 were eluted with methanol containing 1% acetic acid and detected with HPLCMS/MS in positive mode. The recoveries for four compounds were 76.4%－92.3% at fortification levels of 0.1－5

SymbolmA@ g/L in bovine milk and relative standard deviation was in the range of 5.9%－12.5%. The LOD was 0.03

SymbolmA@ g/L and LOQ was 0.1

SymbolmA@ g/L for FB1, FB2 and their hydrolysed metabolites. This method is simple, sensitive, and repeatabilities with satisfied recoveries.

Keywords Milk; Fumonisins; Hydrolysed metabolites; Solid phase extraction; High performance liquid chromatographytandem mass spectrometry

（Received 11 July 2011; accepted 28 December 2011）