牵引成骨中细胞因子的表达及作用

牵引成骨技术(distraction osteogenesis,DO)因其能在原位快速成骨而被称为是一种内源性组织工程技术(endogenous tissues engineer)。自1992年McCarthy首次将DO技术用于下颌骨畸形患者的治疗以来,经过十多年的基础研究与临床实践,DO在颅颌面外科缺损修复重建中的临床运用越来越受到重视。然而,DO的某些并发症(如骨再生不良、延迟愈合、不愈合),特别是较长的疗程及牵引装置长时间留置于面部或口腔内所引发的各种问题(如固定螺钉松脱、伤口感染、骨折等)成为临床运用和推广该技术的瓶颈和主要障碍[1]。近年来,对DO中新骨形成的分子机制做了大量基础性研究,证实牵张机械力引起了多种细胞因子基因的表达增加,提示DO过程中多种细胞因子影响着成骨细胞的增殖、分化及细胞外基质的生物合成和矿化。本文就这方面的研究综述如下。

1转化生长因子-β(transforming growth factorβ,TGF-β)

TGF-β是一组多功能蛋白多肽,广泛存在于动物正常组织细胞及转化细胞中,以骨组织和血小板中含量最为丰富,其在骨形成和骨重建中起着极其重要的作用。TGF-βs能促进成骨细胞、软骨细胞、间质细胞及前成骨细胞的增殖,同时能有效促进胶原合成及非胶原细胞外基质蛋白的表达;此外,TGF-βs能通过抑制基质金属蛋白酶的合成和促进金属蛋白酶组织抑制因子TIMP-1的合成抑制细胞外基质分子的降解[2]。

目前,对DO过程中TGF-β1的表达研究较为深入,多数学者认为TGF-β1在DO的整个过程中均有表达,只是表达水平不同;并且在不同时期表达部位也不同。Mehrara等[3]在鼠下颌DO实验中发现,在潜伏期末TGF-β1表达较未手术组增加2.5倍,牵张初期增加到正常水平的3倍,并且在整个牵张期都保持高水平,直至固定期第4周末才恢复到正常水平;潜伏期及牵张早期TGF-β1主要在截骨线周围的炎症细胞、成骨细胞、间充质细胞、细胞外基质中表达增高;当继续牵引,则高表达于活性成骨细胞、新生成的血管及细胞外基质中的胶原纤维;固定期TGF-β1表达仅局限于牵张间隙中的成骨细胞。Steinbrech等[4]发现TGF-β1随牵张的进行而持续表达,并伴有骨基质的轻度矿化和胶原的活跃合成,而且TGF-β1及其受体的表达广泛存在于皮质切开的骨边缘、骨膜、周围软组织和炎细胞,以及中央纤维形成区的成纤维细胞和各区域的成骨细胞。陈勇等[5]也证实TGF-β1的表达贯穿下颌骨DO的全过程,且TGF-β1mRNA及其蛋白表达在牵引早期达到高峰,此后逐渐减弱,其不同时期表达部位与上述相似。表明牵张机械力刺激可促进TGF-β1的合成和分泌,推测其在牵引成骨中是成骨细胞迁移、分化、胞外基质合成、血管形成的重要调节因子。

然而,外源性TGF-β1对DO中新骨形成作用的研究结果不完全相同。Ozkan等[6]发现外源性TGF-β1增加牵张区新生骨组织的密度和强度;而Rauch等[7]在兔DO实验中局部应用TGF-β1,结果对成骨量及成骨密度均无影响,仅增加了骨痂区的纤维组织。Seiadini等[8]在对胫骨节段性DO研究中,给予外源性重组人TGF-β,结果发现空白对照组和生理盐水组骨明显、连续、稳定、矿化均匀,而注入TGF-β组结果则相反,且随剂量的增加软骨和软骨细胞数量减少,表现出对成骨起抑制作用。表明TGF-βs促进成骨作用在体内可能存在一精确的调节机制,如何利用外源性TGF-βs来促进DO中的骨组织的再生有待进一步研究。

2骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)

BMPs是一种疏水酸性糖蛋白,为TGF-β超家族成员之一,目前已发现的有BMPl-12,其作用具有浓度依赖性,低浓度时能促进细胞趋化和增殖,高浓度时能促进细胞分化和骨形成。Sato等[9]在鼠长骨DO实验中发现,在截骨后4天,BMP-2、-4mRNA可在骨膜下未成熟骨痂中的软骨前体细胞中检测到;截骨后7天,BMP-2、-4mRNA恢复到术前水平;当牵引开始后,BMP-2、-4mRNA在纤维区的软骨细胞,骨细胞和它们的前体细胞中明显表达,约是骨切开时表达量的20倍,在整个牵引期维持较高水平;至固定期BMP-2、-4表达消失;而BMP-6、-7在DO中的表达情况与BMP-2、-4的表达不同,牵张初期,BMP-6仅在成软骨细胞内可以检测得到,随着牵张的进行,BMP-6 mRNA表达渐降低,至固定期不表达;BMP-7在整个实验过程中均未被检测到。推测BMP-6在软骨成骨阶段可能发挥着一定的作用,BMP-7对其成骨无明显影响。Rauch等[10]在对兔胫骨施行牵引成骨术时也证实,在潜伏期,BMP-2、-4表达增加,尤其在骨膜的间充质细胞和成骨细胞十分明显;在牵引期,BMP-2、-4在成纤维细胞和软骨细胞中表达持续升高;当牵引停止后,表达逐渐下降;但Rauch等发现BMP-7的表达与BMP-2、-4的表达同步,且表达的部位也基本类似。这可能与动物模型的建立、检测手段和检测试剂等因素有关。Khanal[11]进行牵引区新生骨组织免疫组化检查发现,潜伏期BMP-2、-4, Smads 1、5、 8的表达仅轻微增加,牵引期表达显著增加而进入固定期则逐渐减弱,认为BMP信号通路在将机械应力转录为生物学效果中起重要作用。

目前,已证实BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-9、BMP-12均有促进新骨形成的作用,其中,以BMP-2促进新骨形成作用最强[12-18]。这些骨形态发生蛋白之间也可能存在协同作用,有文献报道[19-20]重组BMP-2与BMP-7的联合基因治疗较单一应用其中一个更能促进成骨细胞分化成骨。但目前仍然不知道在牵引过程中产生的机械应力是如何激活机体产生相应生物学信号,尚需进一步研究。

3血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)

血管内皮生长因子也称血管渗透因子(vascular permeability factor,VPF),最初是在肿瘤细胞分泌物中发现的,是一种糖基化分泌性多肽因子,具有维持血管正常状态和完整性,增加血管通透性,诱导血管发生,并促进血管生成的作用。Warren等[21]在鼠下颌骨DO实验中发现,在截骨后5～7天 VEGFmRNA的表达增加,在牵引1周左右达高峰,其表达贯穿整个牵引期及固定期,在牵引带成骨细胞和内皮细胞上有高浓度的VEGF表达及强烈的血管生成反应。Byun[22]在狗单侧下颌骨DO过程中检测牵引区VEGF和其两种受体Flt-1、Flk-1,发现牵引7天后牵引区成骨细胞、骨细胞和成纤维细胞中VEGF和其受体表达明显增加,并在成骨细胞和成纤维细胞中维持14天。牵引28天后VEGF和VEGFR-1在成骨细胞中表达减弱,牵引区细胞中无VEGFR-2表达。在整个观察期VEGFR-1明显强于VEGFR-2的表达。Sojo[23]研究发现VEGF在牵引区新生成骨的前部靠近新生成骨的周边的成骨细胞表达,而BMP-2、-4在肥大的软骨细胞中表达。在同一标本中VEGF表达区域比BMP-2、-4表达区域离骨干远,因此认为在成骨之前先有血管生成。Casap[24]在兔下颌骨牵引一侧牵引区应用VEGF后发现应用VEGF部位的新骨生成明显增加,因此,认为VEGF对新骨形成具有积极的作用。但Eckardt等[25]在对兔牵引动物模型中局部导入VEGF或VEGF拮抗剂,结果未发现对新骨形成有明显影响。推测可能是因为机械牵张已刺激VEGF等生长因子的大量产生,导入的外源性VEGF或VEGF拮抗剂不足以发挥作用。另外,导入VEGF的时机、剂量及处理方式等都可能影响新骨形成。

4碱性成纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor,bFGF)

bFGF是一种25kD的多肽,包括至少19个密切相关的单肽,能促进细胞增殖,调节细胞分化,诱导软骨和骨基质合成,与血管内皮生长因子协同作用,可促进血管再生,从而促进骨生成。Yeung等[26]研究bFGF在牵引过程中的表达中发现,在延迟期、牵引期、固定期bFGF均有不同程度的表达。在潜伏期,骨膜和骨髓质区的类纤维原细胞bFGF表达较明显,新形成的成骨细胞也有bFGF的表达;牵引期,正在形成中的骨小梁成骨细胞bFGF有非常强的表达。在新形成骨小梁和纤维组织中,成骨细胞密度比相邻区域明显增高,bFGF的表达也更明显。在固定期bFGF的表达比牵引期明显减弱。刘人恺等[27]在山羊颅骨缝DO实验中发现山羊颅骨缝在受到牵张力作用后bFGF有高水平表达,以牵张结束当天与第2周最为显著,主要定位于成纤维样细胞与成骨细胞,随着固定时间的延长其表达逐渐减弱。

应用外源性bFGF可刺激骨痂形成,促进骨折修复和再生、移植骨愈合及骨缺损修复。Okazaki等[28]对兔胫骨行牵引成骨,牵引结束后,局部注入200μg bFGF,发现能促进牵引区骨形成。在牵引结束后2～5周,发现骨矿化量明显增加,提示在骨牵引的固定期,外源性bFGF的应用可以缩短骨延长时间。将bFGF注入兔胫骨近端骺板后,血管由邻近干骺端长入,加速骨前体细胞的侵入及软骨骨化。朱永云等[29]将外源性bFGF注射到兔下颌骨牵引区,显示牵引区新骨生成速度和数量高于对照组,认为局部导入外源性bFGF可能有促进下颌骨牵引成骨的作用,从而为缩短DO疗程和减少牵引后复发回弹提供了一种可能的途径。

5胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)

胰岛素样生长因子是一类对机体生长发育起重要调节作用并具有胰岛素样代谢效应的因子,目前已发现有IGF-1和IGF-2两种异构体,分别为含有70个和67个氨基酸的单链多肽。IGF-1可由成骨细胞产生并以自分泌方式刺激成骨细胞增殖和基质合成,IGF-2的生理作用与IGF-1相似但作用较弱。Eingartner等[30]研究发现,在DO过程中IGF-l的表达呈现明显的时间性。在牵引早期,血浆中IGF-1水平最先升高,其后牵引带和周围骨组织中IGF-1水平开始升高,这可能是由于受牵引力影响,周围软组织最先释放IGF-1,导致血液中浓度升高的结果。而Meyer等[31]检测牵引成骨时兔血清IGF-1含量发现,在骨切开后IGF-1血清浓度下降,但牵引期其浓度并无明显升高。Yates等[32]研究IGF-1在猪下颌DO早期的作用,发现牵引早期骨膜中IGF-1升高明显,牵引带仅有少量矿化骨质形成;牵引结束后,IGF-1恢复到正常水平,牵引带有大量矿化骨形成。说明IGF-1可能在牵引早期发挥重要作用。王志国等[33]在研究局部应用IGF-1对兔下颌骨DO的影响时发现,实验组和对照组动物在X线片上无明显差异;在组织学观察上,两组在牵张间隙内均见到有大量新生骨小梁生成,骨小梁排列方向与牵引方向一致;组织学分级评价结果显示,实验组新骨生成数量仅比对照组多2.4%,但统计学检验结果表明两组未见显著差异。Schrnid[34]研究发现只有在机体缺乏IGF时,外源性IGF对成骨细胞的分化与增殖才有促进作用。在骨切开术和随后的牵引过程中,局部组织会产生较高浓度的IGF-1,这时候导入外源性IGF-1显得多余。另外,联合应用生长因子可能比单独应用某一种生长因子更有效。

综上所述,在牵引成骨术中牵张机械力能促进多种细胞因子的表达,其参与了牵引区新骨形成及矿化的调节,这为阐明牵引成骨的分子机制奠定了基础;但这些细胞因子表达的时间顺序及之间的相互作用还尚不清楚,此外,对于外源性细胞因子应用的时间、途径及剂量还需深入研究。相信随着对牵引成骨分子机制的研究深入,必将对临床应用和研究产生重要的指导意义,推动牵引成骨的广泛应用。

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[收稿日期]2010-06-07 [修回日期]2010-07-20