疏血通注射液对大鼠体内华法林抗凝作用的影响

时间:2022-04-15 09:01:58

[摘要]研究疏血通注射液对大鼠体内华法林抗凝作用的药效学和药动学影响,为临床合理用药提供参考。进行单剂量华法林研究时,将Wistar大鼠随机分成空白对照组(A组)、疏血通注射液给药组(B组)、华法林对照组(C组)、疏血通注射液与华法林联合给药组(D组);进行稳态华法林研究时,将Wistar大鼠随机分成华法林对照组(E组)、疏血通注射液与华法林联合给药组(F组)。用血凝分析仪测定凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT),并计算国际标准化比值(INR),进行疏血通注射液对单剂量和稳态华法林药效学影响的研究;用UPLC-MS/MS联合手性色谱柱技术测定r-华法林和s-华法林的血药浓度,并计算大鼠体内药代动力学参数,研究疏血通注射液对单剂量和稳态华法林的药动学影响。单剂量华法林实验结果显示,疏血通注射液本身可使大鼠的PT,INR显著升高(P

[关键词] 华法林; 疏血通注射液; 药物相互作用; 抗凝作用

[Abstract] To explore the effect of Shuxuetong injection on the pharmacodynamics and pharmacokinetics of warfarin in rats, and to provide reference for rational drug use. In studies on the single dose of warfarin, Wistar rats were randomly divided into four groups: blank control group(group A), Shuxuetong injection group(group B), warfarin control group(group C), and warfarin+Shuxuetong injection group(group D). In studies on the steady state of warfarin, Wistar rats were randomly divided into warfarin control group(group E) and warfarin+Shuxuetong injection group(group F). To investigate the pharmacodynamic effect of Shuxuetong injection on warfarin, prothrombin time(PT) and activated partial thromboplastin time(APTT) were measured by coagulation analyzer, and international normalized ratio(INR) was calculated. To investigate the pharmacokinetic effect of Shuxuetong injection on warfarin, the blood concentrations of s-warfarin and r-warfarin were determined by UPLC-MS/MS combined with technology of chiral chromatographic column, and the related pharmacokinetic parameters were calculated accordingly. The results on the single dose of warfarin showed that Shuxuetong injection markedly increased PT, INR(P

[Key words] warfarin; Shuxuetong injection; drug interactions; anticoagulant effect

华法林是抗凝治疗的经典药物,临床上主要用于预防和治疗血栓栓塞性疾病,如心脏瓣膜病、房颤、冠心病、肺栓塞和深静脉血栓形成等[1-2]。但华法林治疗窗窄,个体差异大,易受其他因素特别是药物影响而导致抗凝不足或出血风险增加,临床用药存在高风险[3]。

疏血通注射液是由地龙和水蛭为主要成分精制而成的动物类中药复方制剂,具有活血化瘀、通脉活络的功效[4],可用于治疗急性脑梗死、急性心肌梗死、不稳定型心绞痛、糖尿病并发症等。调查结果显示,2010~2012年度全国样本医院治疗脑血管疾病的中药制剂中,疏血通注射液销量排名第一[5]。由于疏血通注射液在心脑血管领域应用广泛,与华法林联合应用的几率较大,但对于两药联用是否会产生药物相互作用尚未见有研究,仅有1例两药联用导致INR升高的个案报道[6]。本实验从药效学和药动学2个方面,研究疏血通注射液Φゼ亮炕法林和稳态华法林抗凝作用的影响及相关机制,为临床合理用药提供参考。

1 材料

Agilent 6430 QQQ-MS质谱仪(美国Agilent公司);Aglient 1290液相仪(美国Agilent公司);G6410数据采集软件(美国Agilent公司);SK 5002双通道血凝分析仪(深圳市盛信康科技有限公司);MC-19R冷冻离心机(昊诺斯生物公司);L550台式低速大容量离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);MS3 digital S25涡旋混合器(德国IKA公司);HGC-12A型氮吹仪(合肥信诺仪器有限责任公司);KQ-500E型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

疏血通注射液(牡丹江友搏药业股份有限公司,2 mL/支,批号15011421);华法林钠片(上海信谊药厂有限公司,2.5 mg/片,批号18130503);华法林钠对照品(中国食品药品检定研究院,批号101163-2001001);r-华法林对照品(加拿大TRC股份有限公司,纯度98%,批号3-MMH-145-3);s-华法林对照品(加拿大TRC股份有限公司,纯度98%,批号3-MMH-134-1);甲氯噻嗪对照品(中国食品药品检定研究院,批号101227-201101);PT试剂(上海太阳生物技术有限公司,批号105216);APTT试剂(上海太阳生物技术有限公司,批号111037);乙腈、甲醇、乙酸铵为色谱纯,其他试剂均为分析纯。

清洁级Wistar大鼠,雄性,体重(200±20) g,购自哈尔滨医科大学实验动物学部,合格证号SYXK(黑)2006-033。

2 方法

2.1 溶液的配制

取1片华法林钠(2.5 mg/片),置于研钵中,加少量聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温80)共研,加入50 mL纯化水混匀,所配溶液华法林钠的质量浓度为0.05 g・L-1。

取1支疏血通注射液(2 mL/支),加入16.5 mL生理盐水稀释,所配溶液疏血通的体积分数为10.8%。

2.2 动物实验

2.2.1 疏血通注射液对单剂量华法林抗凝作用的 影响

将32只Wistar大鼠随机分成空白对照组(A组)、疏血通注射液给药组(B组)、华法林对照组(C组)、华法林-疏血通注射液联合给药组(D组),每组8只。A,C组腹腔注射生理盐水,B,D组给予等量疏血通注射液(5 mL・kg-1),连续处理14 d。第8天,A,B组给予生理盐水灌胃1次,C,D组给予等量华法林溶液(0.2 mg・kg-1),并于设定的采血时间点尾静脉采血。

2.2.2 疏血通注射液对稳态华法林抗凝作用影响

将16只Wistar大鼠随机分成华法林对照组(E组)、华法林-疏血通注射液联合给药组(F组),每组8只,2组大鼠连续灌胃华法林(0.2 mg・kg-1)8 d。第5天,E组腹腔注射生理盐水,F组给予等量疏血通注射液(5 mL・kg-1),并于设定的采血时间点尾静脉采血。

2.3 疏血通注射液对华法林抗凝作用影响的药效学研究

2.3.1 血浆样品的采集与处理

2.3.1.1 疏血通注射液对单剂量华法林抗凝作用影响药效学研究的样品采集与处理 在华法林灌胃处理后开始计时,分别于第0,4,8,12,24,36,48,72,96,120,144小时经尾静脉采集0.1 mL血样置于枸橼酸化离心管中,3 000 r・min-1离心15 min,分离得上清血浆,立即测定凝血指标。

2.3.1.2 疏血通注射液对稳态华法林抗凝作用影响药效学研究的样品采集与处理 在华法林灌胃前开始计时,分别于第1,2,3,4,5,6,7,8天经尾静脉采集0.1 mL血样置于枸橼酸化离心管中,3 000 r・min-1离心15 min,分离得上清血浆,立即测定凝血指标。

2.3.2 凝血指标的测定

2.3.2.1 凝血酶原时间(PT)的测定 取适量PT应用试剂置于血凝分析仪试剂预温位中,37 ℃预热10 min。吸取20 μL血浆移至血凝分析样品杯底部,预温3 min,然后放入测试通道中,用联机专用微量移液器吸取40 μL相对应的PT应用试剂后,记录相应PT。

2.3.2.2 活化部分凝血活酶时间(APTT)的测定 吸取20 μL血浆移至血凝分析样品杯底部,然后加入20 μL APTT试剂置于血凝分析仪样品预温位,预温5 min,然后放入测试通道中,用联机专用微量移液器吸取20 μL CaCl2试剂,记录相应的APTT。

2.4 疏血通注射液对华法林抗凝作用影响的药动学研究

2.4.1 华法林对照品贮备液和内标贮备液的配制

2.4.1.1 s-华法林对照品贮备液配制 精密称取s-华法林对照品5.3 mg置于10 mL量瓶中,甲醇溶解稀释并定容,配制质量浓度为0.53 g・L-1的s-华法林对照品贮备液。

2.4.1.2 r-华法林对照品贮备液配制 精密称取r-华法林对照品5.09 mg置于10 mL量瓶中,甲醇溶解稀释并定容,配制质量浓度为0.509 g・L-1的r-华法林对照品贮备液。

2.4.1.3 内标贮备液的配制 精密称取甲氯噻嗪5.13 mg置于10 mL量瓶中,甲醇溶解稀释并定容,配制质量浓度为0.513 g・L-1的内标贮备液。

以上所有配制好的溶液均置于4 ℃条件下保存,使用前取出,用甲醇稀释至适宜浓度。

2.4.2 血浆样品的采集

2.4.2.1 疏血通注射液对单剂量华法林抗凝作用影响药动学研究的样品采集 在华法林灌胃处理后开始计时,分别于第0.5,1,1.5,2,4,8,12,24,48,72,96,120,144小时经尾静脉采集0.3 mL血样置于肝素化离心管中,9 000 r・min-1离心10 min,分离得上清血浆,置于-20 ℃冰箱保存待测。

2.4.2.2 疏血通注射液对稳态华法林抗凝作用影响药动学研究的样品采集 在华法林灌胃前开始计时,分别于第1,2,3,4,5,6,7,8 天经尾静脉采集0.3 mL血样置于肝素化离心管中,9 000 r・min-1离心10 min,分离得上清血浆,置于-20 ℃冰箱保存待测。

2.4.3 血浆样品的处理

准确吸取100 μL大鼠血浆置于10 mL离心管中,先加入50 μL甲氯噻嗪(2 mg・L-1,内标物),再加20 μL乙酸,涡旋振荡1 min,加入3 mL乙酸乙酯,涡旋振荡2 min后,3 500 r・min-1离心5 min,吸取乙酸乙酯层,40 ℃氮气流下吹干,50%乙腈水100 μL复溶,涡旋振荡1 min,有机微孔滤膜过滤后注入进样杯中待测。

2.4.4 色谱条件

Astec CHIROBIOTIC V手性液相色谱柱(2.1 mm×100 mm,5 μm);流动相乙酸铵-乙腈(85∶15,pH 4.0);流速0.2 mL・min-1;进样体积5 μL;柱温20 ℃。

2.4.5 质谱条件

电喷雾电离源(ESI),扫描方式为多反应监测(MRM),负离子方式检测,毛细管电压4 kV,锥孔电压125 V,氮气流温度350 ℃,流速660 L・h-1。定量分析的华法林离子对m/z为307.0/161.0,碎裂电压115 eV,碰撞能量20 eV,碰撞池加速电压5 V;内标甲氯噻嗪离子对m/z为357.8/321.9,碎裂电压100 eV,碰撞能量8 eV,碰撞池加速电压5 V。

2.5 数据处理

应用SPSS 20.0软件分别统计分析药效学和药动学数据,结果用±s表示,比较组间差异采用t检验,P

3 结果

3.1 疏血通注射液对大鼠体内华法林抗凝作用影响的药效学实验结果

3.1.1 疏血通注射液对大鼠体内单剂量华法林抗凝作用影响的药效学结果

分别测定空白对照组、疏血通注射液给药组、华法林对照组、疏血通注射液与华法林联合给药组的PT,APTT,并根据PT计算INR,结果分别见图1,2,表1(APTT Emax用来表示APTT的峰值,APTT Tmax用来表示APTT的达峰时间)。

以上结果显示,疏血通注射液给药组与空白对照组比较,PT延长,INR增大,APTT峰值升高(P

3.1.2 疏血通注射液对大鼠体内稳态华法林抗凝作用影响的药效学结果

测定华法林对照组、疏血通注射液与华法林联合给药组的PT,并根据PT计算INR,结果见图3,4。

以上结果显示,华法林与疏血通注射液联合给药组与华法林对照组比较,联用疏血通注射液可使PT延长,INR增大,说明疏血通注射液能增强稳态华法林的抗凝效果。

3.2 疏血通注射液对大鼠体内华法林抗凝作用影响的药动学实验结果

3.2.1 疏血通注射液Υ笫筇迥诘ゼ亮炕法林抗凝作用影响的药动学实验结果

华法林对照组、疏血通注射液与华法林联合给药组s-华法林和r-华法林的平均血药浓度和各药代动力学参数分别见表2,3,平均血药浓度-时间曲线图分别见图5,6。

表2,3和图5,6所示,疏血通注射液与华法林联合给药组和华法林对照组比较,合用疏血通注射液后,s-华法林的药动学参数Cmax,AUC0-t,AUC0-∞分别升高了20.12%,15.14%,18.87%(P

3.2.2 疏血通注射液对大鼠体内稳态华法林抗凝作用影响的药动学实验结果

华法林对照组、疏血通注射液与华法林联合给药组s-华法林和r-华法林的平均血药浓度-时间曲线分别见图7,8。

由图7,8所示,华法林与疏血通注射液联合给药组与华法林对照组比较,华法林达稳态后,在合用疏血通注射液的第2天和第3天,s-华法林的血药浓度分别升高了16.39%,17.50%(P

4 讨论

本实验进行疏血通注射液对华法林药效学和药动学影响的研究时,大鼠所用2种药物的剂量均是参考临床实际用药剂量折算所得。

单剂量华法林药效学研究结果表明,疏血通注射液本身具有一定的抗凝血作用,与华法林联用后,PT延长,INR增大(P

单剂量华法林药动学研究结果表明,s-华法林的Cmax,AUC0-t,AUC0-∞,t1/2均升高,CL/F降低,r-华法林的Cmax,AUC0-t,AUC0-∞均升高,CL/F降低。提示疏血通注射液可减慢华法林的代谢,且对s-型和r-型均有影响。

稳态华法林研究结果表明,联用疏血通注射液后,华法林的PT延长,INR增大,s-华法林、r-华法林的血药浓度均升高。提示华法林达稳态后,疏血通注射液可使大鼠体内华法林的药效学和药动学参数均发生变化,使抗凝作用增强。

由华法林单剂量药动学曲线可见,在华法林单剂量组和疏血通注射液与华法林联合给药组中,华法林的达峰浓度均在1.5 h左右;但在药效学曲线中可见,药效达峰时间在36 h左右。华法林的药动学与药效学呈现出的时间不同步性,与其作用机制和特点有关,华法林的作用是通过抑制维生素K依赖的凝血因子Ⅱ,Ⅶ,Ⅸ及Ⅹ的合成,降低相关凝血因子的合成率及削弱凝血因子的生理活性,因此需在体循环的凝血因子清除后,才能达到最大药效,呈现出药效达峰时间滞后于血药浓度达峰时间。由稳态曲线可以看出,随着华法林给药天数的增加,华法林血药浓度与药效呈现出同步增长的趋势,在给予疏血通注射液后,联合给药组中华法林的血药浓度与药效亦呈现同步增加的趋势。

本研究结果显示,疏血通注射液与华法林联合应用除药效学协同抗凝作用外,还产生了代谢性药物相互作用。r-华法林主要经CYP1A2和CYP3A4代谢,而疏血通注射液对CYP1A2,CYP3A4有抑制作用[7],因此疏血通注射液与华法林联用后,可由于疏血通注射液对CYP450酶的抑制作用而使r-华法林代谢减慢,抗凝作用增强。Yamazaki等[8]研究表明,r-华法林的存在有可能影响s-华法林代谢酶的活性,使s-华法林代谢酶的活性降低从而使s-华法林代谢减慢,抗凝作用增强。

结合单剂量和稳态研究结果综合分析,疏血通注射液与华法林联合应用,对华法林的药效学和药动学均可产生影响。联合用药的结果使抗凝作用增强,出血风险增加,因此临床用药过程中应尽量避免疏血通注射液与华法林联合使用,如必须联用,应密切监测,并根据具体情况考虑是否调整华法林剂量,保障患者用药安全。

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[8] Yamazaki H, Inoue K, Shimada T. Roles of two allelic variants (Arg144Cys and Ile359Leu) of cytochrome P450 2C9 in the oxidation of tolbutamide and warfarin by human liver microsomes[J]. Xenobiotica, 1998, 28: 103.

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