VD大鼠血清及脑脊液中IL-6水平变化

【摘要】目的观察血管性痴呆大鼠血清及脑脊液中IL-6水平变化并探讨其意义｡方法采用酶联免疫法测定血管性痴呆大鼠模型组和对照组大鼠血清及脑脊液IL-6水平;并用Y迷宫测两组大鼠学习记忆能力｡结果模型组大鼠脑脊液IL-6水平明显高于血清的水平(t=6.11,P

【关键词】血管性痴呆;IL-6;学习记忆能力

1材料与方法

1.1试剂与仪器大鼠白介素6ELISA试剂盒､

0.01MPBS 购于武汉博士德生物工程有限公司｡

酶标仪由芬兰产MK3型,Y型电迷宫由湘雅医学院行为研究室提供,37℃孵育箱由德国产D91126型,离心机由上海产800型,Eppendorf移液器由德国产｡

1.2动物筛选与分组 健康老年(月龄>10个月)雄性Wistar大鼠20只,体重250～300g,由中南大学湘雅医院实验动物中心提供｡大鼠适应环境7d后,先将大鼠放入迷宫箱中,适应5min,使其对三臂均探索进入,然后从I臂开始随机次序变换测试,给电压30～70V,电流0.5～0.7mA,延迟时间5s,电击后大鼠逃避至安全区为正确反应,否则为错误反应｡每测1次休息30s,测10次休息5min｡大鼠学习记忆成绩以连续10次测试中有9次(9/10)正确反应时,所需电击数表示｡测试在上午进行,连续30次未跑正确者被淘汰(共淘汰1只)｡再将动物按随机数字表法分为模型组10只,对照组9只｡

1.3动物模型的制作

适应环境7d后,将Wistar大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0 .3～0.35g/Kg) 进行麻醉,麻醉完全后,将大鼠固定在手术台上,剪去颈前部毛发,常规消毒铺洞巾,在颈前侧旁颈前三角处纵向切开皮肤约2cm,分离筋膜后可见气管旁的颈动脉鞘,打开动脉鞘,把颈总动脉与迷走神经分开,用4号线对颈总动脉进行双重结扎,然后缝合皮肤,局部洒上庆大霉素,术后肌注青霉素40 000IU,Bid X 3d｡4d后以同样的方法结扎另一侧颈总动脉｡对照组2次手术间隔相同的时间,但只分离出双侧颈总动脉,不予结扎,余操作步骤同上｡术后各组大鼠予以自然饮食｡模型组麻醉死亡1只｡

1.4术后大鼠行为学观察

学习记忆观察:各组在同时间点(一侧颈总动脉术后15､30､60d)按前述说明进行Y迷宫测试,规定大鼠受电击后从起步区直接逃至安全区为正确反应,所需电击次数表示其学习记忆获得能力｡若次数超过30次则不再测试,并以30次为最大值计数｡

1.5采集标本

一侧颈总动脉结扎60d后用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉,然后迅速开胸暴露心脏,从心脏采血5ml ,再迅速从大鼠的枕骨大孔处取脑脊液｡

1.6标本制备

采集的血液在室温下静置2h,离心1 500Xg15min,收集血清于干净的EB管中-20℃冷冻保存｡收集的脑脊液亦于-20℃冷冻保存｡

1. 7白介素(IL-6)的检测按大鼠白介素6ELISA试剂盒要求的步骤检测大鼠血清及脑脊液中的IL-6水平

1.8数据收集处理

统计各组大鼠迷宫学习记忆获得能力测试的尝试次数以均数±标准差(x±s)表示｡大鼠血清及脑脊液IL-6含量以均数±标准差表示｡实验数据用SPSS11.0统计软件分析,样本均数的比较采用配对t检验｡

2结果

2.1记忆能力的观察评分见表1｡

术前两组大鼠学习记忆能力基本一致｡术后对照组大鼠迷宫学习记忆无显著影响,而模型组大鼠主动逃避电击的明显少于对照组,而且随着时间的推移,所需电击次数反而增加,说明该组大鼠学习记忆能力明显下降,存在学习障碍｡

3 讨论

3.1IL-6的分子生物学特性IL-6分子量为26Kda,是一种典型的具有多种生物学功能的细胞因子,主要参与机体细胞免疫,炎症反应,造血调控

等｡机体内多种有核细胞都可产生IL-6,如单核细胞 ､T细胞､B细胞､成纤维细胞､内皮细胞､星形胶质细胞和小胶质细胞等｡除细胞能合成IL-6外,多种细胞因子如IL1､TNFa､INFr都能合成IL-6｡脑组织内产生IL-6的细胞可能主要是星形胶质细胞和小胶质细胞[1]｡胶质细胞表达细胞因子是对周围或局部刺激的反应,受到刺激或病毒感染的星形胶质细胞和小胶质细胞均可诱导产生IL-6｡但是有些学者认为神经元细胞也是产生IL-6的主要细胞[2]｡IL-6 的多能性是由广泛表达于多种细胞表面的IL-6受体介导的,IL-6R由α链和β链(gp130)组成｡在信号传递过程中,IL-6与IL-6R结合,可进一步触发IL-6R与gp130在细胞外区的结合,形成具有信号传导功能的高亲和力复合物,以JAK/STAT信号传递途径与RAS传递途径参与靶细胞的信号传导功能[3],可能涉及依赖于NFkB 和NFIL6 的转录作用[4],引起靶基因的转录表达,发挥生物学功能｡

3.2IL-6在血清及脑脊液中的表达及作用我们实验的模型组脑脊液IL-6水平均高于血清,这提示IL-6可产生于脑组织中,并非完全由外周组织产生,通过血脑屏障进入脑脊液中,而主要是脑组织产生的,主要包括星形胶质细胞､小胶质细胞､神经元细胞和TNFα ､IL1等炎性因子｡有学者认为实验性缺血再灌注模型与临床卒中患者血清及脑脊液均可出现IL-6升高[56],CSF中达到最高值的时间早于在血浆中最高值的时间,脑组织中出现最晚,这与我们研究结果IL-6主要由脑组织产生是一致的｡而本实验结果模型组血清及脑脊液中IL-6含量远远高于对照组,与对照组相比较P

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