IGF-1对大鼠局灶性脑损伤Bcl-2表达的影响

摘要： 目的：研究胰岛素样生长因子-1（igf-1）对大鼠局灶性脑缺血再灌注后Bcl-2 表达 的影响及与缺血时间关系，探讨IGF-1对脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法：制作SD大鼠 大脑中动脉缺血再灌注模型。将55只SD雄性大鼠随机分为假手术组（n=5）、对照组（ n=25 ）、IGF-1治疗组（n=25），其中后两组按缺血再灌时间(6h，12h，1d，3d，7d)不同 可分为 5个亚组，每组5只，治疗组于缺血2h再灌注1h后经腹腔注入40μg/kg稀释为1ml 的IG F-1，假手术组及对照组同时腹腔注入生理盐水1ml。以上动物均在再灌注后规定时间点用4 % 多聚甲醛经心脏灌注固定，取大鼠脑组织，应用免疫组化S-P法和HE染色检测Bcl-2蛋白表 达 及脑组织结构病理变化。结果：与对照组相比，治疗组大鼠脑组织Bcl-2表达明显增加，其 神经细胞坏死程度明显减轻。结论：IGF-1在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中起保护作用， 其作用机制包括增加Bcl-2蛋白的表达，发挥其神经保护作用。

关键词：胰岛素样生长因子-1；局灶性脑缺血；Bcl-2；再灌注损伤

中图分类号： Q959.837; R743 文献标识码： A 文章编号： 1008-2409(2008)05-0891-03

Effects of IGF-1 on expression of Bcl-2 in rats following focal cerebral injur e/LI Kai-rong，LI Wang-hui，XIAO Hong-wen，et al.∥Department o f Anatomy， Luzhou Medical College， Luzhou 646000, China

Abstract: Objective: To evaluate the protective effect of insulin-like growt hfactor-1(IGF-1) on focal cerebral ischemia reperfusion in rat. Methods: Theh ealthyof male SD rats(55) were divided randomly into sham operation group (5),model group(25) and IGF-1 group(25), each of the model group and IGF-1 gr ou p was further divided into 5 subgroups according to the duration of reperfusion( 6,12,24hours,3 day,7 day) after two hour of cerebral ischemia. The n the rats in sham operation and model group were injected normal saline. IGF -1 group were injected IGF-1 through abdominal cavity. Brain tissue of rats we reused to observe nerve cell injury under light microscope after HE staining, andpositive neurons of Bcl-2 were observed by immunohistochemical method. Results : Compared with the model group, the injury degree of neuron greatly reduced i nthe IGF-1 group(P

胰岛素样生长因子-1（Insulin-like growth factor-1,IGF-1）为一种多肽类激素，是 一种 重要的调节神经生长的物质，对前体细胞增殖有促进作用，它不仅是脑发育所必需的，而且 在脑缺血（再灌注）等多种病理状态下对机体发挥重要保护作用。Wu等［1］研究 表明局灶 性脑缺血再灌注损伤可提高内源性IGF-1表达。另有研究表明［2］，凋亡相关基因B cl-2蛋白 可以有效地支持神经细胞的生存，对脑缺血有保护作用，但经腹腔给IGF-1能否减轻实验大 鼠缺血再灌注损伤及是否通过促进Bcl-2蛋白的表达而起保护作用，目前国内外尚无文献报 道。本实验采用血管内栓堵大脑中动脉建立大鼠局灶性脑缺血模型，观察局灶性脑缺血再灌 注不同时间后应用IGF-1对缺血侧脑组织病理改变及Bcl-2表达的影响，为胰岛素样生长因 子-1的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠55只，体重在250～310g之间，由泸州医学院动物中心提供，随 机分为假手术组（5只）、缺血对照组（25只）、IGF-1治疗组（25只）。IGF-1由武汉博 士德生物制剂有限公司提供。

1.2 大鼠局灶性脑缺血模型的制作

参照袁琼兰等［3］改良短暂局灶性脑缺血模型。大鼠腹腔 注射10%水合氯醛（350mg/kg）麻醉后，仰卧固定，颈部正中切口分离并暴露右颈总动脉、 右颈外动脉、右颈内动脉，用4.0丝线结扎颈总动脉及颈外动脉,在颈内动脉起始处打一松结 。在颈总动脉近分叉处剪一V型切口，插入尼龙线(长50mm,直径0.23mm,18mm处作标记)，插 入长度约17.5～18.5mm感到有轻微阻力时停止，扎紧并固定插线,缝合皮肤，阻断血流2h 后拔除插入尼龙线约10mm再灌注，术后自由喂养。假手术组条件同上，但置线栓深度为10mm 。治疗组于缺血2h再灌注1h后经腹腔注入稀释为1ml的40μg/kg IGF-1，假手术组及 对照组同时腹腔注入生理盐水1ml。术中用白炽灯加温，维持大鼠肛温37℃左右。大鼠苏醒 后行神经功能评分：0分：无神经功能缺失症状；1分：不能完全伸展对侧前爪者；2分：爬 行时出现左侧转圈者；3分：行走时向身体瘫痪侧倾倒者；4分：不能自发行走，意识丧失者 ，选择评分1～3分者为造模成功进入实验。

1.3 光镜标本制作

假手术组于术后48h处死大鼠，其他两组于缺血再灌注后规定时间点 （6h，12h，1d，3d，7d）取材。将实验用大鼠分别经10%水合氯醛深度麻醉(600mg/kg)，迅 速打开胸腔，暴露心脏，剪开右心房，于心尖部剪开左心室，插管至主动脉 ，先以150ml生 理盐水冲洗血液，随后以4℃的含4％多聚甲醛的0.1mol／L PBS液先快后慢灌注固定2h后取 脑,常规脱水、透明、石蜡包埋，连续冠状切片，切片厚度4μm，切片贴附于预处理的载玻 片，分别作常规HE染色、Bcl-2蛋白免疫组化检测。

1.4 HE染色

将切片经脱蜡水化后，行苏木精-伊红（HE）染色，56℃温箱内浸染20min, 光镜下观察缺血侧大脑海马的组织形态学变化。

1.5 Bcl-2蛋白免疫组织化学检测

兔抗大鼠Bcl-2单克隆抗体及链霉素抗生物素蛋白-过氧化 物酶(SP)免疫组化试剂盒由武汉博士德生物制剂有限公司提供。标本切片常规脱蜡、水化， 按试剂盒提供的实验步骤进行操作。DAB染色光镜下观测，胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性着 色。

1.6 统计学处理及图像分析

应用BX-50(olympus)光学显微镜，镜下在各区域随机观察取4个 不重叠视野摄片并高倍镜下400(倍)细胞计数,以均数±标准差（±s）表示 。利用SPSS-14.0统计分析软件进行资料统计学处理,组间比较采用F检验。

2 结果

2.1 HE染色结果

假手术组海马区神经细胞排列整齐，细胞呈多角形，核圆形、清晰，细胞 边界清楚，胞浆染成淡红色，胞核呈蓝色。缺血组可见海马区细胞排列紊乱，见较多梭形和 三角形的缺血神经元，细胞周围间隙增大更加明显，并出现许多坏死细胞遗留的空隙，海马 带宽窄不一，其中再灌注6～48h渐呈损伤加重，3d出现严重的缺血性损伤，3～7d逐渐 改善，与假手术组比较有显著差异。IGF-1治疗组海马锥体细胞排列较整齐，少数锥体细胞 体积缩小，核不规则、深染。存活的锥体神经元数量较多。

2．2 形态学变化

Bcl-2蛋白的染色主要显示为棕黄色(见图中箭头所指为阳性细胞)，集 中表达于手术缺血侧大脑半球神经细胞胞浆及核膜内。假手术组脑组织内Bcl-2蛋白阳性细 胞仅少量表达（图1）；缺血再灌注对照组缺血灶周边区内可见较多细胞胞浆和胞核染成棕 黄色的Bcl-2蛋白阳性细胞(图2)，以海马多见，主要为神经元，而缺血中心仅少量阳性染 色 细胞，主要为血管内皮细胞；IGF-1治疗组切片中的Bcl-2蛋白阳性细胞显著增加（图3） 。

2.3 Bcl-2蛋白的表达

镜下观察海马CAI 区Bcl-2免疫反应为胞浆着色，呈弥漫性或棕黄 色颗粒。对照组缺血缺氧后 6h海马CAI 区Bcl-2表达逐渐增强，24 h时表达明显高于假手 术 组(P

3 讨论

Bcl-2家族成员分为抗凋亡和促凋亡两大类，其代表分别是Bcl-2和Bax，在线粒体介导的 神 经细胞凋亡通路中发挥重要作用。Bcl-2基因表达产物主要定位于线粒体膜、内质网膜和核 膜上，其功能与抑制细胞凋亡、延长细胞生存有关。Bcl-2蛋白可抑制多种因素导致神经元 凋亡，包括缺氧、放射性损伤等。正常脑部表达很少的Bcl-2［4］，在缺血等应激 后立早基因 和转录因子的表达导致Bcl-2家族成员的激活。Greco等［5］采用免疫组化方法观 察Bcl-2在 缺血后及再灌注过程中，有不同程度的表达增加，具有抗损伤作用，但其促进或抑制细胞凋 亡的作用机制仍不清楚。相对分子质量为29000的Bcl-2蛋白是必需的膜蛋白，主要位于线 粒体膜、核膜和内质网膜中，如此分布显示出Bcl-2蛋白与细胞内反应性氧化片断(ROS)的 形 成密切相关，而ROS已被证实是细胞凋亡调控的重要因子,通过细胞内ROS或内源性抗氧化物 质的生成，Bcl-2蛋白发挥其抗氧化作用而抑制细胞凋亡［6］。

胰岛素样生长因子-1是一类促进合成代谢、具有抗凋亡作用的细胞因子，其与许多系统疾 病 、冠心病、肾功能衰竭、视网膜病变等有关。局灶性缺氧缺血性脑损伤对脑中风患者危害很 大，可导致多种神经系统后遗症，其早期防治尤为重要。IGF-1对维持神经细胞生存生长和 损伤后修复具有极其重要的作用［7,8］,被认为与缺血性脑损害修复密切相关。

动物实验中大多采用侧脑室给药，但创伤较大，如果应用于临床患者难以接受。也有经腹腔 注射者,Sizonenko等［9］通过比较大鼠脑缺血后侧脑室和腹腔注射这两种不同的给 药方式，认为IGF-1腹腔注射神经保护范围更大，疗效更佳。

本实验结果显示，假手术组大鼠皮质及海马均有少数bcl-2蛋白表达，缺血再灌注6h组B cl-2在缺血侧皮质海马轻度表达，其中在海马表达明显，24h达高峰，以后逐渐下降。 其 表达在24h内随组织缺血程度的增加而升高，并随再灌注时间延长而发生动态变化。同时 还发现，缺血周边区Bcl-2表达较中心区强烈，提示Bcl-2在损伤相对轻的神经元中表达更 显 著。本实验发现给予胰岛素样生长因子-1治疗大鼠持续性局灶性脑缺血再灌注6h，12 h，1d，3d，7d能有效地减少神经损伤，与以前关于IGF-1对缺血性脑损伤脑内神经细 胞 作用的研究［10］一致，推测胰岛素样生长因子-1可使大鼠对持续性局灶性脑缺血 产生耐受， 其对缺血性脑损伤的作用机制可能是IGF-1能有效提高脑组织Bcl-2含量，发挥其阻止 脑细胞凋亡、减轻神经功能损伤的作用。

参考文献：

［1］ WU H Y,FAN J Z,LUO R,et al.Changes of insulin-like g rowth factor-I i n focal cerebral ischemical reperfusion injury in rats［J］.Nan Fang Yi Ke Da Xu e Xue Bao,2008,28(4):598.

［2］ SOLAROGLU I,TSUBOKAWA T,CAHILL J,et al.Anti-apoptotic effe ct of granuloc yte-colony stimulating factor after focal cerebral ischemia in the rat［J］.Neu roscience,2006,143(4):965-974.

［3］ 袁琼兰，李瑞祥，羊惠君，等.改良的短暂局灶性脑缺血模型［J］.四川 解剖学杂志，1998，6(2)：65-68.

［4］ MERRY D E,VEIS D J,HICKEY W F,et al.Bcl-2 protein expressi on is widespreadin the develoing nervous system and retained in thePNS［J］.Development, 1994,120(2): 301-311.

［5］ GRECO R,AMANTEA D,BLANDINI F,et al.Neuroprotective effect o f nitroglycer in in a rodent model of ischemic stroke: evaluation of Bcl-2 expression［J］.In t Rev Neurobiol,2007,82:423.

［6］ CHOI J M,SHIN H K,KIM K Y,et al.Neuroprotective effect o f cilostazol aga inst focal cerebral ischemia via antiapoptotic action in rats［J］.J Pharmacol E xp Ther,2002,300(3):787-793.

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［8］ D’ ERCOLE A J,Y E P,O’ KUSKY J R.Mutant mouse models of i nsulin-like growthfactor actions in the central nervous system［J］．Neuropeptides，2002，36：209 -220.

［9］ SIZONENKO S V,SIRIMANNE E S,WILLIAMS C E,et al.Neuroprotect ive efects of th e N-terminal tripeptide of IGF-1,glycine-proline-glutamate in the immaturerat brain after hypoxic-ischemic injury［J］．Brain Res，2001,922 (1)：42-50.

［10］ 王琳娜，崔景彬.IGF-1对缺血性脑损伤大鼠脑内神经发生的影响 ［J］.现代生物医学进展，2008，8（1）：30.

(收稿日期： 2008-08-05)