P53基因家族的表达与结\直肠癌发生及预后关系的研究

【摘要】 目的 研究P53基因家族(P53、P63、P73)在结、直肠癌组织中的表达,探讨其与结、直肠癌患者发生和预后的关系。方法 选取58例新鲜结、直肠癌组织、50例结、直肠息肉标本,用PCR检测P53基因外显子5,P63基因外显子6,P73基因外显子2进行分子遗传学的检测。结果 43例结直肠癌患者,37例结、直肠息肉组织及P53基因家族均有表达,15例结直肠癌患者,13例结、直肠息肉组织未表达P53基因家族。结论 P53基因家族表达结、直肠癌的发生有密切关系,P53基因家族表达缺失的患者易发生癌变以及预后更差。

【关键词】结、直肠癌;P53; P63; P73; 抑癌基因; 聚合酶链反应

The study on gene expression of p53 、p63、p73 in colorectal tumours and the relations with cancerous and prognosis

XIONG Liang fa,WANG Li,JIA Ling,et al.Department of carcinoma,the first people,s hospital of yunnan province,Kunming 650032,China

【Abstract】 Objective This study was undertaken to investigate theexpression of p53、p63and p73 gene in colorectal cancers,and analysis correlation of p53、p63and p73 with originating and prognosis of colorectal tumors.Methods Using a polymerase chain reaction(PCR)approach,we analysed the expression in exon5 of p53,exon6 of p63,exon2 of p73 in 58 human colorectal cancer and 50 colorectal polypi patients.Results 43of 58 colorectal tumour patients expressed P53 gene group,37 of 50 colorectal polypi patients expressed P53 gene group.Conclusion There was affinity between P53 gene group and the colorectal tumour patients’ prognosis.

【Key words】 p53; p63;p73;Colorectal tumor;Gene;Suppress gene; PCR

云南省第一人民医院肿瘤外科(熊亮发 贾玲 杨昆宪 孙建伟), 麻醉手术科(王莉); 昆明医学院第一附属医院普通外科(段体德)

一直以来,P53基因是肿瘤生物学研究的重点。作为肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene),它的缺失或失活与人类50%以上肿瘤的发生、发展密切相关[1],因而受到人们的广泛关注。1997年后P53基因家族成员相继被发现。Kaghad等首先发现了P53基因的第一个类似基因 P73基因,随后Schmale等以及其他几个研究小组各自独立发现了P53基因家族的第二个基因 P63基因[2]。P53基因家族各个成员在结构和功能上具有相似性,全长表达的P63、P73基因蛋白可激活p53相关靶基因,能触发细胞周期停滞,诱导凋亡,因而认为可能是候选的肿瘤抑制基因[3 5]。但是,P53、P63、P73基因家族表达与结直肠癌之间的关系,目前少见报道。

1 资料与方法

1.1 一般资料

58例结直肠癌标本及癌旁组织标本来自昆明医学院第一附属医院、云南省第一人民医院、云南省肿瘤医院手术切除的新鲜标本;50例结直肠息肉来自昆明医学院第一附属医院结直肠纤维内窥镜室;所有标本从患者体内取出后,不经任何处理,一部分放入液氮中保存备用,另一部分做成石蜡标本。本组病例标本,只选取经术后病理诊断分期为Duke’sC期的结直肠癌患者,并且所有结直肠癌患者术后都使用FOLOFOX4方案化疗6月,治疗后均随访5年。另外40例结直肠息肉患者有6例有癌变或者不典型增生,其余为绒毛状腺瘤和管状腺瘤。

1.2 主要实验用品

1.2.1 蛋白酶K:20 mg蛋白酶K溶解于1 ml灭菌ddH2o中, 20℃保存。

1.2.2 TE缓冲液:10 mmol/L Tris Hcl,1 mmol/L EDTA,pH8。0;灭菌后,4℃保存。

1.2.3 琼脂糖电泳上样缓冲液:0.25 g溴酚兰,0.25%二甲苯青FF,30%甘油水溶液。

1.2.4 5×TBE:54 gTris,27.5 g硼酸,4.8 gNa2EDTA,加入ddH2o至1000 ml,搅拌溶解,室温下保存备用。

1.2.5 TaqDNA聚合酶:购于北京华美生物工程公司和上海Sangon生物公司。

1.2.6 低熔点琼脂糖:购于美国FMCBIO公司。

1.3 实验用分子量标准 PUC19 DNA/MSPI,为MBI产品,购于大连宝生物工程公司;DL2000 购于上海华舜生物工程有限公司。

1.4 引物 根据NCBI数据库自行设计,由上海Sagon生物工程公司合成。

表1

目的基因外显子引物序列扩增片段

P5355’TTCCTCTTCCTGCAGTACTC3’158 bp

3’GACTCCAGACCAAACGTTGA5’

P6365’GCCACCAACATCCTGTTCATGC3’

3’GTTGTGGAGATACCTGACTCATCTG5’259 bp

P7325’AGCGAAGGTGGCTGAGGCTAG3’

3’ACAGGAGGACAGAGCACGAGT5’252 bp

1.5 主要仪器

1.5.1 PTC 225DNA热循环仪(美国MJResearch公司)

1.5.2梯度PCR仪(美国Epperdorf公司)

1.5.39700型PCR仪(美国Perkin Elmer公司)

1.5.4紫外反式投射仪(美国BIO RAD公司)

1.5.5东方恒压恒流电泳仪DF C(北京东方仪器厂)

1.5.6电泳槽DYYIII28A/28B(北京六一仪器厂)

1.5.7SORVALL(MC12V)离心机(美国Dupont公司)

1.5.8DNAMAXI dry plus真空抽干仪(丹麦Heto Holton公司)

1.5.9 脱色摇床(江苏海门麒麟医用仪器厂)

1.5.10 MultiTemp型恒温水循环泵(瑞典Pharmacia Biotech公司)

2 研究方法

2.1结直肠组织块的处理 取少量组织块,放入一个1.5 ml离心管中,置于液氮上,在离心管加入少量液氮,用组织捣碎棒将组织捣成粉末,再将离心管从液氮中移出,静置片刻待液氮完全挥发掉。

2.2结直肠组织的细胞消化:DNA提取 A. 加入100ulDP液和10ulProteinase K,迅速振荡混匀,置于55℃温浴至组织完全消化(一般为过夜消化)后,加入200ulDL液,振荡混匀,放置55℃温浴5 min;B. 加入100ul异丙醇,剧烈颠倒离心管混匀后,全部移至吸附柱中,离心30 s(12000转/min),弃去收集管中的液体,将吸附柱放入同一收集管;C. 加入500ulW1液静置1 min后,离心30 s,弃去收集管液体,再用500ulW1液洗脱一次,将吸附柱移入另一干净收集管中;D.在吸附柱中央加入50ulT1液,55℃/65℃静置5 min后,离心1 min。将收集管中液体(DNA) 20℃保存备用。

2.3样品DNA检测 1%琼脂糖凝胶电泳,拖尾严重的DNA弃去不用。

2.4PCR扩增(Polymerase Chain Rraction Amplification) 各个基因外显子,扩增体系均为25 μl;dNTP(2.5 mM)0.25 μl,MgCL2(25 mM)1.5 μl,10×buffer(Mg2+Free)2.5 μl,Taq酶0.3 μl(1 u/μl),两种引物P1、P2各1 μl(12.5 μmol/L),DNA模板2 μl(50~100 ng),ddH2O16.45 μl。矿物油20 μl覆盖。反应在DNA扩增仪上进行。扩增条件:95℃,4 min;循环条件:95℃30 s,64.8℃30 s,72℃50 s,循环30次;72℃延伸10 min。PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳,结束后拍照。P53、P63、P73基因的外显子退火温度各不相同,P53的退火温度为61℃,P63为62.8℃,P73为64.8℃。

2.5 统计学方法 数据用卡方检验进行组间及组内显著性检验,取P

3 实验结果

3.1 PCR扩增产物分析 58例结直肠癌、50例结肠息肉P53基因家族表达示意图见图1、图2、图3。

图1 P53基因外显子7扩增片段

图2 P63基因外显子6扩增片段

图3 P73基因外显子2扩增片段

从图1、2、3可以看出P53基因1和5这两个标本出现表达缺失,P73基因的4号标本出现表达缺失。所有标本表达情况见表2。

表2

P53基因家族表达情况

例数表达(结直肠癌)不表达例数表达(结直肠息肉)不表达

P53基因4711428

P63基因562482

P73基因562473

表3

P53基因家族表达缺失与结直肠癌

患者5年生存关系

5年后存活5年内死亡χ2值P值

P53基因家族表达3013

P53基因家族不表达694.19

表4

P53基因家族表达缺失与结直肠息肉

恶变倾向关系

良性腺瘤癌变或不典型增生χ2值P值

P53基因家族表达316

P53基因家族不表达587.68

3 讨论

自分子生物学技术问世以来,在肿瘤的发生机制、发展过程调控的研究上已取得了飞跃的发展。目前的研究表明:肿瘤的发生、发展是细胞中多种基因突变累积的结果。就结、直肠癌而言,P53基因出现缺失或突变等因素参与下,结直肠息肉容易向癌变方向进展。1997年后,Kaghad等首先发现了P53基因的第一个类似基因 P73基因,随后Schmale等以及其他几个研究小组各自独立发现了P53基因家族的第二个基因 P63基因[2]。它们是否具有和P53基因相同的功能或者和P53基因具有协同功效,目前国内外少见报道。我们的研究发现,58例结直肠癌患者中,有的患者有P53基因的缺失,有的患者有P63或P73基因的表达缺失(P53基因家族表达缺失),但是无一例患者同时出现两个或者两个以上基因的表达缺失,其中原因需要进一步研究。从结直肠癌患者的5年生存率分析,P53基因家族表达缺失的结直肠癌患者的5年生存率要低于P53基因有表达的患者(P

参考文献

[1] Sheikh MS,et al.Role of p53 family memmenbers in apoptosisJ Cell Physiol,2000,182(2):171 81.

[2] chmale H,et al.A novor protein with strong homology to the tumor suppressor P53.Oncogene,1997,15(11):1363 1367.

[3] Shimada A,et al.The transcriptional activities of p53 and its homologue p51/p63:similarities and difference.Cancer Res,1999,59(12):2781 2786.

[4] Lohrum MA,et al.Regulation and function of the p53 related protein:same family,different rules.Trend cell Biol,2000,10(5):197 202.

[5] Yang A,et al.P63,a p53 homology at 3q27 29,encodes multiple products with transactivating,death inducing,and dominant negative activitiesMol Cell,1998,2(3):305 316.