一株片烟中纤维素降解菌的筛选鉴定及其初步应用研究

摘要采用刚果红平板法从津巴布韦醇化片烟上筛选纤维素降解菌，根据形态学、生理生化特征以及16S rRNA核酸序列对所筛菌株进行鉴定，并对其酶学性质和片烟降解进行研究。结果表明：初步鉴定所筛得产纤维素酶活较高的菌株C-11属于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。该菌株所产纤维素酶催化最适温度为50 ℃、最适pH值为7.0。Fe3+和Ca2+对酶活力有促进作用，Mg2+对酶活力影响较小，而K+、Co2+、Zn2+、Na+对酶活力有不同程度的抑制作用。该菌株所产纤维素酶降解片烟中纤维素的最适温度为50 ℃，最适时间为2 h，片烟中的纤维素失重率达到41.23%。

关键词片烟；纤维素降解菌；枯草芽孢杆菌；筛选；鉴定

中图分类号TS41+1文献标识码A文章编号 1007-5739（2011）08-0025-04

ScreeningandIdentificationofaCelluloseDegradationBacteriafromTobaccoLaminaandItsPreliminaryApplication

WANG Ying 1FAN Jian-qiang 2BAO Ke-xiang 2WANG Jin-hua 1 *WANG Zhi 1

（1 Key Laboratory of Fermentation Engineering，Ministry of Education，Hubei University of Technology，WuhanHubei 430068；

2 China Tobacco Fujian Industrial Corporation）

AbstractA strain of producting extracellular cellulase degradation bacteria was isolated from tobacco lamina surface of Zimbabwe.It was identified by its morphological，physiological and biochemical properities and 16S rRNA sequence analysis，its cellulase properties and tobacco degradation were also researched. The results showed that the strain C-11 with high enzyme activity of cellulose by preliminary evaluation was Bacillus stbtilis，optimum reaction temperature was 50 ℃ and optimum pH value was 7.0.The cellulase activity improved by Fe3+ and Ca2+，effect of Mg2+ on cellulase activity was smaller and cellulase activity decreased in various degrees by K+，Co2+，Zn2+ and Na+.The optimum temperature of cellulose degradation by cellulases from tobacco lamina was 50 ℃，and the optimum reaction time was 2 hours，loss-weight rate of cellulose in tobacco leaf reached 41.23%.

Key wordstobacco lamina；cellulose degradation bacteria；Bacillus subtilis；screening；identification

烟草焦油是烟草中的大分子物质如纤维素、木质素等在缺氧条件下不完全燃烧的产物，是众多烃类、烃氧化物、烃硫化物、烃氮化物等极其复杂的混合物，包括苯并芘、亚硝胺和苯酚类等多种致癌物质[1]。随着吸烟的危害逐渐被人们认识和重视，国内外卷烟市场也出现了向低焦油、低烟碱卷烟发展的趋势。

目前，减害降焦主要是通过改良烟草品种[2]、改善烟叶加工技术[3]、采用生物滤嘴[4]和滤棒[5]、采用纳米材料[6]等物理或化学途径来实现。国内外研究表明，通过微生物发酵能够明显缩短烟叶醇化的时间，减轻燃吸引起的刺激性，并对烟叶香气质量的改善有一定的促进作用。特别是利用微生物或酶制剂发酵技术，能够促进烟叶、烟草薄片及烟梗内部大分子有机物质的分解与转化，从而改善它们的品质和减少苯并芘、亚硝胺等有害物质的产生[7-10]，但研究大多采用外源微生物对烟叶进行处理。该文从醇化后的津巴布韦片烟中分离到纤维素降解菌，从形态学、生理生化特性和16S rRNA生物学手段对其进行鉴定，用其所产纤维素酶对片烟进行初步降解研究，以为利用微生物进行降焦减害提供参考依据。

1材料与方法

1．1试验材料

1.1.1培养基。①液体富集培养基：CMC-Na 5.0 g/L，NH4NO3 1.0 g/L，酵母膏1 g/L，MgSO4・7H2O 0.5 g/L，KH2PO4 1 g/L。②筛选培养基：CMC-Na 5.0 g/L，NH4NO3 1.0 g/L，酵母膏1 g/L， MgSO4・7H2O 0.5 g/L，KH2PO4 1 g/L，琼脂15 g/L。③种子培养基：小麦秸秆粉2.5 g/L，蛋白胨10 g/L，K2HPO4 6 g/L，KH2PO4 3 g/L，MnSO4・H2O 0.2 g/L，MgSO4・7H2O 1 g/L，豆饼粉2 g/L，酵母粉0.4 g/L，pH值自然。④发酵培养基：小麦秸秆粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，K2HPO4 6 g/L，KH2PO4 3 g/L，MnSO4・H2O 0.2 g/L，MgSO4・7H2O 1 g/L，豆饼粉2 g/L，酵母粉0.4 g/L，pH值自然。

1.1.2试剂和原料。选用津巴布韦片烟，小麦秸秆粉、豆饼粉为市售，其他试剂均为市售分析纯。中性洗涤剂：按Van Soest方法配制；2 mol/L盐酸溶液：167 mL浓盐酸（比重1.19）用蒸馏水定容至1 000 mL；72%浓酸溶液：665 mL H2SO4（ 比重1.84）加入300 mL水中，冷至20 ℃，补加水至1 000 mL。

1.2试验方法

1.2.1纤维素降解菌的富集及筛选。称取碾碎后的片烟2 g，加入含有50 mL液体富集培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃、220 r/min培养48 h后，取富集后的培养液稀释涂布至筛选培养基平板上，37 ℃培养48~72 h，进行甘果红染色，选择生长较好、透明圈较大的菌株接于斜面和种子培养基中。

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1.2.2粗酶液的制备。接种3 mL种子培养基中液体于装有50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，于28 ℃摇床220 r/min，培养3 d，取菌液至1.5 mL离心管中，10 000 r/min离心5 min，上清液即为粗酶液。

1.2.3酶活的测定。取4支10 mL刻度的比色管，各加pH值为7.0的1% CMC-Na缓冲溶液1.5 mL。再分别准确加入稀释好的待测酶液0.5 mL于3只样品管中。于空白管中加入灭活酶液0.5 mL。摇匀后50 ℃保温30 min，然后加入DNS溶液2 mL。摇匀后将4支比色管同时放入沸水浴中，准确计时5 min，取出，迅速冷却至室温，用纯水定容至5 mL，540 nm下测定吸光值[11]。

酶活力单位：1 mL纤维素酶液1 min水解纤维素生成1 μmol葡萄糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位（U）。

1.2.4菌株形态学观察及生理生化鉴定。形态学观察：在菌株生长平板上观察菌落形态。再经过革兰氏染色和芽孢染色后，通过光学显微镜观察菌体形态特征。生理生化鉴定：参照《伯杰氏细菌手册》相关内容进行[12]。

1.2.5菌株分析生物学鉴定。参考Ludwing[13]等人的方法，设计通用引物对分离到的菌株总DNA作为PCR扩增模板，扩增菌株16S rRNA。将扩增产物送往华大基因北京研究中心进行基因测序，然后将得到的16S rRNA序列提交到NCBI核酸数据库中进行BLAST在线分析[14]。之后从NCBI的核酸数据库中随机选取报道中的部分芽孢杆菌16S rRNA序列，应用CLUSTAL 8.1和Mega 5.0软件采用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统进化树并分析。

1.2.6酶学性质初步研究。温度对酶活力的影响：粗酶液与含1%CMC-Na缓冲液分别在30、40、50、60、70 ℃条件下保温30 min，测定其酶活力。pH值对酶活力的影响：将粗酶液分别加入1%CMC-Na的pH值5.0（醋酸-醋酸钠）缓冲溶液、pH值6.0~7.0（磷酸氢二钠-磷酸二氢钠）缓冲溶液、pH值8.0~9.0（硼酸-硼砂）缓冲溶液中，50 ℃反应30 min，测定酶活。金属离子对酶活力的影响：在pH值7.0，50℃的反应温度下，分别加入0.01 mol/L K+、Fe3+、Mg2+、Ca2+、Co2+、Zn2+、Na+金属化合物，其阴离子均为Cl-，以消除其他离子对试验结果的影响，然后测定酶活[15]。

1.2.7降解片烟纤维素的初步研究。温度对酶降解片烟纤维素的影响：酶液与片烟分别在30、40、50、60、70 ℃条件下反应2 h，于80 ℃烘干至恒重，测定纤维素含量。时间对酶降解片烟纤维素的影响：酶液与片烟在50 ℃条件下反应不同的时间后，于80 ℃烘干至恒重，测定纤维素含量。纤维素含量的测定：称取片烟1.000 0 g置于100 mL碘量瓶中，加入70 mL中性洗涤剂于115~121 ℃保温20 min，取出用3号30 mL沙芯坩埚过滤，依次用95%乙醇、无水乙醇和丙酮洗涤2次，将残渣置真空干燥器中，干燥20 min；再将残渣连同坩埚置于100 mL烧杯中，加入70 mL 2 mol/L盐酸溶液，然后放入已沸的高压锅，100 ℃保温50 min，过滤，依次用95%乙醇、无水乙醇和丙酮洗涤2次，残渣于80 ℃烘至衡重为W1；将残渣连同坩埚置于150 mL烧杯中，加入10 mL致冷的72%硫酸，20℃降解4 h后加入90 mL蒸馏水，室温过夜，次日用蒸馏水洗残，烘干至衡重为W2（W1、W2为纤维素的含量）。

纤维素失重率（%）=×100

式中，a为处理前纤维素含量，b为处理后纤维素含量。

2结果与分析

2.1菌株的筛选

经过筛选，选出25株能够产生透明圈的菌株。分别置于装有50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶，28 ℃摇床220 r/m培养3 d，测定酶活。其中C-11菌株酶活力最高，为1.90 U/mL，且产酶稳定。以此作为后续研究对象。

2.2菌株C-11的形态学特征

C-11菌株在培养基中培养3 d后，形成3 mm左右菌落，菌落乳白色，近圆形，不透明，表面干燥、无光泽。该菌经光学显微镜观察呈杆状。

2.3菌株C-11的生理生化特征

部分生理生化结果见表1。

2.4菌株C-11的16S rRNA鉴定

菌株C-11的16S rRNA测序得到1456bp的序列。于NCBI数据库中序列进行BLAST对比后，利用CLUSTAL 8.1 和Mega 5.0软件构建系统进化树，结果如图1所示。C-11与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）相似性达99%。结合C-11的菌落形态、生理生化结果以及16S rRNA分析，初步鉴定C-11菌株为枯草芽孢杆菌。

2.5菌株C-11酶学性质的初步研究

2.5.1温度对酶活力的影响。由图2可知，C-11菌株所产纤维素酶在40~60 ℃时酶的活力较高，50 ℃为最适的酶反应温度。

2.5.3金属离子对酶活力的影响。由图4可知，Fe3+和Ca2+对酶活力有促进作用，Mg2+对酶活力影响较小，而K+、Co2+、Zn2+、Na+对酶活力有不同程度的抑制作用。这与李德莹等[15]所报道的Mg2+对酶活力有激活作用、Ca2+对酶活力影响不大有所出入。可能是因为绿色木霉与细菌所产纤维素酶不同，导致其酶学性质也有所差异。因为Ca2+能控制细胞的生理状态，调节质膜的通透性，维持细胞体内的渗透压等，同时Ca2+也是某些酶的激活剂。Fe3+可能在酶与底物之间起了连桥作用，形成复合物，从而更有利于底物与酶的活性中心必须基团结合，而使酶活力提高。

2.6片烟纤维素降解结果

2.6.1温度对纤维素失重率的影响。由图5可知，菌株C-11所产纤维素酶在50℃时对片烟中纤维素降解效果较好。当温度超过50℃的时候，纤维素失重率明显降低。

2.6.2时间对纤维素失重率的影响。由图6可知，反应时间小于2 h时，菌株C-11所产纤维素酶对片烟中纤维素降解效率较差。但是当反应时间超过2 h时，随着时间的延长，纤维素的失重率提高不明显。

2.6.3降解前后片烟表面观察结果。由图7、8可知，片烟在进行纤维素酶处理前表面结构紧凑，且无孔洞；片烟在纤维素酶处理后表面结构有所改变，出现了裂缝且存在孔洞。表明菌株C-11所产纤维素酶对片烟中纤维素有降解效果。

3结论与讨论

从片烟表面筛出的高产纤维素酶枯草芽孢杆菌菌株C-11，其产纤维素酶达到最大值1.90 U/mL。通过生理生化、16S rRNA鉴定，初步鉴定该菌为枯草芽孢杆菌。对其酶学性质研究表明，C-11菌株所产纤维素酶活稳定，在pH值6.0~8.0、温度40~60 ℃都有较高活力。酶催化的最适pH值为7.0，最适温度为50℃。Fe3+和Ca2+对酶活力有促进作用，Mg2+对酶活力影响较小，而K+、Co2+、Zn2+、Na+对酶活力有不同程度的抑制作用。对片烟进行初步酶处理研究表明，该酶对片烟处理的最佳酶解温度为50 ℃，最适酶解时间为2 h。通过扫面电子显微镜对酶处理前后片烟表面的观察，也从侧面表明菌株C-11所产纤维素酶对片烟中的纤维素有降解作用。

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该高产菌产酶稳定，在微生物处理醇化片烟、降解大分子物质过程中处于重要地位。从片烟表面筛选的纤维素降解菌和其所产酶可直接投入到醇化后片烟中，降解纤维素含量，减少其不完全燃烧产生的有害物质，提高香烟品质。

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注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文

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