一株拮抗放线菌GLP-27菌株发酵液抗菌谱及稳定性的研究

摘要：研究了土壤放线菌GLP-27次生代谢产物的抗菌谱及其发酵液的稳定性，采用抑制菌丝生长速率法、管碟法测定发酵液的生物活性，在不同条件下测定发酵液的稳定性。结果表明：在对12种供试病原真菌的抑制效果中,6种达到80%以上。在连续传代10代过程中,4℃及常温条件保存下,培养特征和抑菌活性基本没有变化。发酵液在60～100℃的温度梯度下没有丧失活性,在pH值为2和12的强酸、碱条件下也都比较稳定。

关键词：放线菌；发酵液；抗菌谱；稳定性

收稿日期：2011-06-04

作者简介：侯勇（1983―），男，湖北公安人，硕士，主要从事实验室教学和管理工作。

中图分类号：Q939.132文献标识码：A文章编号：1674-9944（2011）07-0235-03

1引言

农用抗生素是用来杀虫、灭菌、除草以及调节植物生长等的微生物的活体及其代谢产物。放线菌是创制抗生素的主要来源,从微生物中分离的生物活性物质有60%以上为放线菌的次级代谢产物［1］,例如农药井冈霉素、农抗120、中生霉素和武夷菌素等,而且农用抗生素以其高效、低毒等优点,越来越受到各国的青睐［2］。因此,从放线菌中寻找农用活性物质有较为广阔的前景。本研究从山东省鲁东地区采集的土样中分离得到一株土壤放线菌,编号为GLP-27,该菌株对多种植物病原真菌具有强烈的抑制作用。在确定其具有广谱抗菌活性后,又对菌株及其所代谢的发酵液的稳定性作了系统的研究。

2材料与方法

2.1供试菌株

菌株GLP-27是从山东省鲁东地区采集的土壤中分离得到的一株放线菌。接种于试管斜面培养基,4℃保存。

2.2供试病原菌

小麦赤霉病菌（Gibberella zeae）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）、辣椒枯萎病菌（Fusarium oxsporum）、黄瓜灰霉病菌（Borrytis cinerea）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、水稻稻瘟病菌（Pyricularia）、苹果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、烟灰霉病菌（Botrytis cinerea）、马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）、苹果腐烂病菌（Cytospora mandshurica）、油菜菌核病菌（Sclerotiua sclerotiorum）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

2.3培养基

（1）固体培养基。PDA培养基、高氏一号培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。

（2）液体培养基。小米10g,葡萄糖10g,CaCO3 2g,,NaCl 2.5g,,蛋白胨3g,蒸馏水1 000mL,pH值7.2～7.4,1×10 Pa灭菌30min。

2.4发酵液的制备

将保存的菌种接种于高氏一号平面培养基上,置28℃恒温培养箱培养4d。将培养好的菌落取出放入液体培养液中。转速150r/min,28℃三角瓶发酵5d后过滤,发酵液在4℃冰箱中保存备用。

2.5发酵液抗菌谱测定

2.5.1抑制菌丝生产速率法

取10mL发酵液与90mL已融化的PDA培养基混合均匀,倒入无菌的培养皿中制成带药培养基平板。接种直径4mm的供试病原菌菌饼,每处理3次重复。置28℃恒温培养,以无菌水处理为对照。4d后用十字交叉法测量菌落直径,计算抑制率［3］。

菌丝生长抑制率（%）

×100%。

2.5.2管碟法

将供试菌与适量培养基充分混匀,倒入9cm培养基中制成带菌平板,每个平板上放上3个牛津杯（内径0.6cm,外经0.8cm,高1.0cm的不锈钢杯）,每管加入发酵原液0.2mL,以蒸馏水为对照,置25℃恒温培养箱中培养20h后,用十字交叉法测量抑菌圈直径［4］。

2.6GLP-27菌株及发酵液的稳定性

2.6.1GLP-27菌株的传代稳定性

将GLP-27菌株在高氏一号平面培养基上每隔7d传代1次,连续传10代,然后观察各代菌株的培养特征,进行各代菌株发酵液的抑菌活性测定［5］。

2.6.2GLP-27菌株在不同温度条件下的稳定性

将GLP-27菌株单一菌落转接到2支大试管斜面上,分别置于4℃冰箱和室温下保存,然后分别隔一段时间转接高氏一号平面培养基上。用抑制菌丝生长速率法测定抑菌活性。

2.6.3GLP-27菌株发酵液的热稳定性测定

将发酵液于60、70、80、90、100℃分别处理30min后,以未经处理的发酵液为对照,应用抑制菌丝生长速率法测定抑菌活性。重复3次。

2.6.4酸、碱对发酵液的稳定性

将GLP-27菌株发酵液用1mol/L HCl和1mol/L NaOH分别调整pH值为2和12的溶液静置12h,再分别将各发酵液的pH值慢慢调至原发酵液pH为6.5,测定其对病原菌的抑制率。以未经处理的发酵液为对照,重复3次。

3实验结果与分析

3.1GLP-27菌株发酵液抑菌谱测定结果

GLP-27菌株发酵液对部分病原菌都有比较好的抑菌效果。从表1看出,在测试的12中植物病原真菌中,对玉米小斑病菌、油菜菌核病菌和黄瓜灰霉病菌的抑制效果最好,达到95%以上,除辣椒枯萎病菌、小麦赤霉病菌和水稻纹枯病菌外,对其它病原真菌的抑制率亦达到70%以上。采用管碟法对供试细菌的测试数据表明,发酵原液对枯草芽孢杆菌的作用不强,抑制圈直径为15.00mm。

表1放线菌GLP-27菌株发酵液抑菌谱测定

3.2GLP-27菌株的传代稳定性

3.2.1培养特征的变化

在GLP-27菌株的传代过程中与原始菌株具有相同的特征。气生菌丝发达,无色。基内菌丝无色。从各代培养特征看,GLP-27菌株在连续传代过程中表现稳定。

3.2.2抗菌活性的变化

GLP-27菌株连续培养10代,对各代放线菌发酵液做抗菌活性测定,表2数据表明菌株GLP-27的抗菌活性非常稳定。

表2放线菌GLP-27各代菌株发酵液抑菌活性测定

3.3GLP-27菌株保存不同温度下的稳定性

从表3可以看出,GLP-27菌株无论在4℃,还是室温下保存,所产生发酵液的抑菌活性都是稳定的。菌株在保存60d后,其发酵液对病原菌的抑菌活性基本没有变化。

表3不同温度下GLP-27发酵液对油菜菌核病菌的抑菌活性变化

3.4GLP-27菌株发酵液的热稳定性

GLP-27菌株发酵液具有较强的热稳定性,与对照相比,在100℃下处理30min,其抗菌活性没有明显变化。见表4。

表4GLP-27菌株发酵液的热稳定性

3.5GLP-27菌株发酵液的酸碱稳定性

从表5中可以看出,发酵液经过酸、碱处理12h后,对5种指示菌的抗菌活性没有显著变化,这说明该菌株产生的活性物质的耐酸、碱能力都比较强。

表5酸、碱对GLP-27菌株发酵液抑菌活性的影响

4结语

通过室内生物活性测试研究结果表明,GLP-27菌株发酵液对多种植物病原真菌的菌丝生长具有很好的抑制作用,抗菌谱较广,尤其是对玉米小斑病菌、油菜菌核病菌和黄瓜灰霉病菌的抑制最为强烈,抑制率达到90%以上。关于它的作用机制有待进一步的研究。通过对GLP-27菌株发酵液连续传代、不同温度下保存的研究,其代谢产物的抗菌能力保持稳定。而且GLP-27所产生的抗菌物质在高温、强酸和强碱的环境下依然具有显著的抑制活性。这为活性成分的分离纯化提供了参考,从本研究可以看出,GLP-27菌株发酵液有较好的抑菌活性,该菌株具有一定的开发价值,对该菌株的鉴定及活性组分分离正在进一步研究中。

参考文献：

［1］ 沈寅初.农用抗生素研究开发新进展［J］.国外医药抗生素分册,1998,19（2）:155～160.

［2］ 于凤玉,李振华.曾会才.抗真菌农药抗生素的研究进展［J］.热带农业科学,2005,25（1）:60～65.

［3］ 吴文君.植物化学保护实验技术导论［M］.西安：陕西科学技术出版社,1988:43～173.

［4］ 刘翠娟,段琦梅,安德荣.抗真菌拮抗放线菌的筛选及摇床发酵条件的优化［J］.微生物学杂志,2004,24（4）:12～14.

［5］ 张波,白红进,付骋宇,等.农用抗生素产生菌Z139菌株的稳定性［J］.植物保护,2004,30（5）:26～29.

Study on Antimicrobial Spectrum and Stability of Strain Fermentation Extracts

Produced by Antagonistic Actinomycete GLP-27

Hou Yong,Zhao Wenhua

（Zhongshan Vocational and Technical College,Guangdong,Zhongshan 528404,China）

Abstract:The objective of this paper is to study the antimicrobial spectrum and stability of the strain fermentation extracts produced by antagonistic actinomycete GLP-27.By means of the method of inhibiting mycelial growth rate and cylinder plate method,the study determines the biological activity of fermentation extracts.The stability of the fermentation extracts under different conditions are measured.The results show that: （1） during the inhabit effects of twelve kinds of tested pathogenic fungi,there are six of them reaching over 80%; （2） in the course of continuous subcultures of 10 generations and under the conditions of 4 ℃ and normal temperature,the stability of antibiotic productivity and cultural characteristics of strain GLP-27 are not altered; （3） the fermentation extracts do not lose activity under the temperature gradient of 60 ～ 100 ℃,and they are stable under the conditions of PH2 and PH12.Therefore,it is proved that the fermentation extracts of GLP-27 are worth of developing for they have broad-spectrum antimicrobial activity and strong stability.

Key words:actinomyces;fermentation extracts;antimicrobial spectrum;stability