静态压力刺激对大鼠“足三里”穴区及穴旁区域成纤维细胞PGE2和IL-6释放影响的比较研究

作者/陈　波　罗永芬　崔　瑾　冯玲媚　杨孝芳　冯　麟

[摘　要]　目的：通过探讨机械刺激对大鼠“足三里”穴筋膜组织成纤维细胞的压力信号生物转换作用，为腧穴“感受刺激，防治痰病”的现代医学生物学机制提供理论与实验依据。方法：体外培养大鼠“足三里”穴及穴旁区域的筋膜组织细胞，对细胞进行形态学鉴定后，实施压力刺激并检测细胞外培养液中前列腺素E2(PGE2)和白细胞介素－6(IL-6)含量的变化。结果：“足三里”穴及穴旁区域的筋膜组织细胞主要都是成纤维细胞，压力刺激均能够促进细胞PGE2和IL-6合成释放的增加，差异有统计学意义。结论：腧穴与非穴的筋膜组织成纤维细胞皆能直接感受刺激，从而将机械信号转换为生物信号。

[主题词]　穴，足三里；成纤维细胞／针灸效应，信号传递；物理刺激

文章编号：0255-2930(2007)02-0135-06

中图分类号：R245．2　文献标识码：A

腧穴是人体脏腑经络气血输注并散发于体表的部位，它不仅能够反映病候以协助诊断，更重要的是，腧穴在感受毫针针刺与推拿按摩的机械性刺激后，还能激发出本身所固有的调节功能，从而发挥其防治疾病的作用。那么，腧穴究竟是如何感受机械性刺激，并将无机的机械信号转换为有机的生物信号的呢?目前，对此大多是从神经生物学机制的角度进行解释的，但实际上，在实施机械刺激的腧穴局部，除了各种神经装置外，其他组织和细胞也是直接暴露于治疗操作的力学环境之下的，理论上就更有可能主动地参与腧穴“感受刺激”的信号转换过程。由于在腧穴特性的研究中，“足三里”穴有着典型的代表意义，因此，对其附着组织的主要细胞群体――筋膜结缔组织成纤维细胞机械力学信号生物转换作用的研究，将有助于补充神经生物学机制对腧穴研究的不足，从而更全面地阐述腧穴“感受刺激，防治疾病”的一般生物学原理。

1　材料与方法

1．1　材料

(1)实验动物、主要培养试剂及检测试剂

健康3月龄雄性SD大鼠32只(由四川抗菌工业研究所动物中心提供，合格证：川实动管质第041307号)，DMEM培养基(GIBCO，USA)，小牛血清(GIBCO，USA)，胰蛋白酶(DIFCO，USA)，EDTA(SIGMA，Israel)，PGE试剂盒(上海森雄公司)，IL-6试剂盒(深圳晶美公司)。

(2)主要实验器材

C02培养箱(Heraeus，Germany)，倒置相差显微镜及组像系统、体视显微镜(olympus，Japan)，离心机(北京医用分析仪器厂)，气压传导压力加载装置(自制)，HTS 7000 Plus多孔板(紫外／荧光／可见光)高效分析仪(PE，USA)，6孔培养板，100 mL细胞培养瓶，微量加样枪，滤菌器等。

1．2　腧穴与非穴筋膜组织细胞的原代培养及传代

(1)腧穴筋膜组织细胞的原代培养及传代

对32只SD大鼠分别进行“足三里”穴区皮下组织块取样，体视显微镜下分离其中的筋膜结缔组织，按酶消化法，无菌条件下剪碎组织块，移入无菌小瓶中，加入O．25％胰酶1 mL，混匀，37℃，5％C02孵箱内培养10～15 min，每5 min振摇1次；加入含10％小牛血清的DMEM培养基终止消化；离心，1000r／min，8 min，收集筋膜组织细胞；然后加入含20％小牛血清的DMEM培养基，混匀；转移至100mL培养瓶中，CO孵箱内继续培养。细胞贴壁后，每隔2天换液，每日观察生长状况，细胞生长达80％融合时，传代培养，镜下连续记录细胞形态并进行细胞形态学鉴定。

(2)非穴筋膜组织细胞的原代培养及传代

对上述大鼠进行“足三里”穴区皮下组织块取样的同时，于穴旁5分以上距离区域同步切取皮下组织块，体视显微镜下分离其中的筋膜结缔组织，按相同方法获取筋膜组织细胞并进行原代培养、传代培养、生长记录及细胞形态学鉴定。

1．3　细胞力学加载实验

(1)气压传导压力加载装置

气压传导压力加载装置――自制带压力表及压力气囊的压力锅；装置设计原理采用气体传导静压力的静压加压法；装置制作方法参考相关文献方法进行。

(2)细胞在6孔板上的接种培养及加力前处理

分别取第7～8代腧穴筋膜组织细胞和非穴筋膜组织细胞，弃培养液，加入O．25％胰酶和O．1％EDTA混合消化液消化细胞，约3～5 min；当瓶底出现针孔样透明时，用含10％小牛血清的DMEM终止消化细胞，调整细胞密度，按2×10。／mL接种于6孔培养板；显微镜下见细胞完全贴壁生长后，继续培养72h；弃含10％小牛血清的DMEM培养液，准确更换含5％小牛血清的DMEM培养液3 mL，再培养24h，使细胞同步化，备用。

(3)实验设计及操作

①实验设计

实验采用3因素(细胞因素、力学因素和时间因素)析因方差实验设计进行。将实验大鼠腧穴筋膜组织细胞样本(n=32)随机分为压力刺激组(n=16)和空白对照组(n：16)，每个组下根据不同处理时间又各设4h和8h共两个检测点，每个检测点均包含8个样本；同时将非穴筋膜组织细胞进行相同分组处理，从而动态比较压力刺激对腧穴与非穴筋膜组织细胞生物学状况的影响。

②空白对照组处理

将空白对照组细胞置于37℃含5％CO孵箱中，不施加压力刺激，于压力组实验开始的同时，分别继续培养4h和8h，于每个时间点上取出细胞培养板，提取细胞培养液以备检测。

③压力刺激组处理

将压力刺激组细胞置于压力装置中，然后移入37。C含59／6CO孵箱中，以孵箱内59／CO加95％空气组成的混合气体加压，维持压力装置内的压力达50kPa，分别继续培养4h和8h，于每个时间点上取出细胞培养板，提取细胞培养液以备检测。

1．4　指标检测

(1)细胞鉴定采用形态学鉴定方法进行。

(2)PGE2测定采用上海森雄公司酶联免疫吸附竞争试剂盒法。

(3)IL-6测定采用深圳晶美公司酶联免疫吸附试剂盒法。

1．5　统计学处理

形态学资料采用直接对比法；数据资料采用SPSS 12．0统计软件中广义线性模型(General Lin―ear Model，GLM)的单变量(Univariate)过程析因方差分析(Factorial Analysis)进行检验，比较细胞因素、力学因素和时间因素在实验组与对照组之间的差异有无统计学意义。

2　结果

2．1　细胞鉴定

在倒置相差显微镜下，腧穴与非穴的筋膜组织细胞在传代接种时，由于细胞密度低、数量少且分散，细胞开始贴壁生长时呈小圆形或短梭形(见图1、图2箭头所示)；当细胞生长达到一定密度后生长融合，细胞梭形变长，胞体丰满，胞浆均匀，核圆形或

卵圆形，核仁清晰，细胞群体单层生长，呈漩涡状、栅栏状、放射状外观(见图3、图4箭头所示)。

两种细胞的形态学特点都符合正常成纤维细胞在形态学上的共同特征。因此，从形态学上可以鉴定本次实验的实验对象――腧穴与非穴的筋膜组织细胞均主要为成纤维细胞，且腧穴与非穴成纤维细胞在形态学上无明显差异。

2．2　压力刺激对腧穴与非穴成纤维细胞PGE合成释放的影响

不同实验因素对成纤维细胞合成释放PGE2的影响不同，见表1。统计分析显示：力学因素、细胞因素与时间因素之间，力学因素是促进腧穴与非穴成纤维细胞合成释放PGE的主要因素，其差异有统计学意义(P＜0．05)；而细胞因素和时间因素对PGE合成释放的影响均无统计学意义(P＞0．05)。

2．3　压力刺激对腧穴与非穴成纤维细胞IL-6合成释放的影响

不同实验因素对成纤维细胞合成释放IL－6的影响见表2。经统计分析，力学因素、细胞因素与时间因素之间，力学因素是促进腧穴与非穴成纤维细胞合成释放IL－6的主要因素，其差异有统计学意义(P＜0．01)，细胞因素和时间因素对IL－6合成释放的影响均无统计学意义(P＞0．05)。

3　讨论

3．1　筋膜结缔组织成纤维细胞是经脉腧穴主要组织的主要细胞群体

通过多年的反复研究，近年来，越来越多的经络腧穴研究者开始逐步把目光更多地注视于过去没有引起充分重视的筋膜结缔组织上来，认为经络穴位的物质基础是在以结缔组织为基础，连带其中的血管、神经丛和淋巴管等交织而成的复杂体系之中。这个由结缔组织结构联系起来的体系，不仅是各种器官、组织和细胞的载体，而且与细胞进行着物质、信息和能量的传输和调节，构成一个对生物机体内外环境能作出反应的动态平衡体系。

结缔组织起源于胚胎时期的间充质，在体内广泛分布，一般认为具有连接、支持、营养和保护等多种功能。但目前发现结缔组织的许多重要功能尚未充分认识，其细胞组成以未分化的潜能细胞为主，其中，细胞数量最多的是成纤维细胞。

3．2　压力是毫针针刺和推拿按摩的基本力学作用形式之一

从历史发展的角度看，对经脉和穴位最原始的刺激方式应是以手指(或手掌)对阿是穴的按压(或按揉)。生产力的发展促使人类发明了针具，针具的使用使得人手的功能得到进一步延伸。原始的针具大而粗糙，针刺时，穴位除了明显的组织损伤外，针体也会对其周围组织产生明显的侧向挤压作用，因此压力刺激是腧穴应力刺激最原始的一种作用方式。

随着推拿按摩治疗技术的发展，手法逐渐多样化，而与此同时，生产力的发展也使得针具的生产工艺日益精细，毫针的各种操作手法日渐丰富起来，这时，压力刺激已不再是针推治疗的主要力学刺激形式，其他力学形式(如提插力、捻转力、牵张力、摩擦力和剪切力)的刺激作用显得越来越重要，但仔细分析，这些变化都不能否定压力刺激仍然是针推治疗过程中腧穴应力刺激最基本的力学作用方式之一。

3．3　腧穴感受刺激现代研究的困境与思考

现代研究认为，腧穴通过各种穴位感受器感受刺激，穴位感受器的物质基础就是能将刺激转换为神经冲动的各种感觉感受器。这些穴位感受器将机械信号转换为生物电信号(神经冲动)后，一方面传递到大脑皮质形成针感，另一方面通过各级中枢的反射或调制，对内脏和躯体活动进行调控(神经调节或神经一体液调节)。临床针推治疗的适应证广泛，目前对其作用机理的现代研究，究其根本几乎都是在该神经生物机制的基础上进行解释的，因为一旦脱离该机制，已有的经络腧穴研究将无法解决机械信号输入、整合，以及对其他系统的输出、调控问题，因此，神经生物学机制似乎是腧穴“感受刺激，防治疾病”惟一的生物学机制。然而，当神经系统发生疾患时，在信号的感受、传递、整合或者传出等诸多环节大多存在功能障碍，而为什么针推临床的很多有效病种恰恰又是神经系统方面的疾病呢?

重新审视一个常见的针灸临床现象时笔者发现，一部分患者在开始接受针刺治疗时，即便是取穴准确，针刺操作得当，还是会遇到患者不得气的情况。这时，医生通常会采取“留针候气”或“循弹催气”的方法以促使患者得气。事实上，借助于留针的静态机械刺激，或通过循弹手法的动态机械刺激，大多数患者是能够产生酸胀得气感的；即便是始终没有得气感出现的患者中，在治疗结束时，也仍然还是有部分患者能够体现出一定的治疗效应的。根据已有的科学基础，可以肯定的是：穴位感受器的物质基础虽然属于神经组织，但神经组织不仅能够感受机械刺激，而且同机体的其他组织器官一样，同样能够感受周围生化环境的变化，从而调整自身的功能，适应正常生理活动的需要。因此，在理论上，对“留针候气”或“循弹催气”等上述临床现象的解释就可能是，不依赖于神经生物学机制，穴区的其他组织细胞同时也直接参与了机械信号向生物信号的转换过程；这种生物信号可能包含某些生化信号分子，这些分子在细胞间隙的弥散，一方面作用于穴位感受器，促进了对机械刺激失敏的、功能低下的穴位感受器重新恢复正常的机械信号感受功能；另一方面，作用于其他组织和器官(包括神经组织的其他部分)，介导了腧穴其他不同治疗功能的发挥。但是，如果要证实腧穴存在非神经途径的作用机制，其关键的第一步就是要证明腧穴的非神经组织和细胞，特别是基本组织的主要细胞――筋膜结缔组织成纤维细胞究竟能不能感受机械力的刺激，能不能将机械信号转换为生物化学信号。

研究中，最理想的实验方法是直接探讨腧穴筋膜成纤维细胞在机体内的生理状态下对机械刺激诱导的各种反应。可是神经系统的敏感性、复杂性以及体内众多的环境因素(如血液循环、组织液流动等)将使体内研究难以区别单一效应或特定的联合效应，直接控制或检测以上诸多理化因素的影响是很困难的。所以，为了屏蔽这些因素的干扰，尝试体外培养腧穴筋膜组织成纤维细胞，进行离体的细胞力学刺激就成为本次研究的实验手段。

3．4　腧穴筋膜结缔组织成纤维细胞机械信号生物转换作用的针灸推拿学意义

(1)腧穴与非穴筋膜结缔组织成纤维细胞机械信号生物转换作用的差别研究

此次研究选取“足三里”穴筋膜组织成纤维细胞为研究对象，“足三里”属胃经合穴，是人体重要穴位之一，在腧穴特性的研究中有广泛的代表意义；选取“足三里”穴旁开5分以上距离的筋膜组织成纤维细胞为非穴对照组的研究对象。研究发现，腧穴成纤维细胞可以感受力学刺激，促进细胞合成释放PGE和IL－6，从而将无机的机械刺激信号转换为有机的生物化学信号；研究同时也发现，腧穴与非穴成纤维细胞对力学刺激的机械信号生物转换作用在实验中并无显著性差异。

回顾腧穴感受力学刺激的生物学机制时，笔者发现，首先从神经生物学机制上看：腧穴与非穴的神

经感受装置在结构上本身并无本质的不同，只是穴区的神经感受装置分布比非穴区多，但就相同的神经感受装置而言，其相同机械刺激信号的生物转换机制目前也并未见有不同报道；其次从非神经生物学机制上看：现代医学生物学多个领域的研究其实已经证实，机体其他广泛分布的组织细胞同样能够感受各种应力刺激，静态、动态生理力学刺激和外界应力刺激对细胞的形态、生化特性有重要影响，细胞的一个自伺放大机制可使一个短暂的刺激如应力刺激转换为一个持续的细胞反应，机械力对组织细胞的作用类似激素和其他生物活性物质，这些生化介质在将机械负荷转换为生物反应过程中起到了重要的作用。但针灸推拿学在该领域的基础研究，目前尚未见报道。

因此，虽然笔者此次研究并未发现腧穴与非穴筋膜组织成纤维细胞的机械信号生物转换作用有何明显差异，但是，如果考虑到整体状况下腧穴可以通过经脉进行生物信号级联传递的特性，那么重点研究腧穴筋膜组织细胞对力学刺激信号的生物转换作用，也是可以为全面认识腧穴的一般生物学特性、突破单一神经机制的限制提供新的实验依据的。

(2)压力刺激促进腧穴成纤维细胞PGE合成释放的意义

PGE2是众多前列腺素(PGs)中的一种。PGs广泛分布于人和哺乳动物的组织与体液中，对机体神经、心血管、泌尿、生殖、呼吸、消化、造血和免疫等多种生理病理功能起着重要的调节作用。人和哺乳动物组织的各种细胞(除红细胞外)均可合成PGs。PGs的合成与释放，首先都要动员不饱和脂肪酸，这种不饱和脂肪酸存在于细胞膜结构中呈结合状态的磷脂内。当刺激因素作用于细胞时，细胞膜磷脂上的磷酸酯酶，主要是磷酸酯酶A(PLA)被激活，作用于磷脂，释放出不饱和脂肪酸――花生四烯酸(AA)，AA先在细胞微粒体经脂肪酸环加氧酶催化，将氧加到不饱和脂肪酸上，形成15羟前列腺内过氧化物――PGG2，然后经前列腺内过氧化酶的催化生成PGH2。PGG2和PGH2在水中不稳定，它们在37℃时半衰期为5min，可自动地或在酶的作用下转化为PGE2、PGD2a、PGF2、PGl2和血栓素A2(TXA2)等各种PGs。不同类型的PGs可因结构上的细小差异而显示不同的生理活性，有的甚至相反，因而各种PGs在体内含量的增减和相互比例的失调均可导致有关生理功能的变化，对许多疾病的病理学和治疗学都有重要意义，至于具体合成哪一种则取决于当时的生理需要。

压力作为针推机械刺激的一种基本力学作用形式，其促进腧穴筋膜结缔组织成纤维细胞PGE2合成释放的关键意义在于：①离体培养的腧穴筋膜组织成纤维细胞在压力作用下能够启动PGE的合成释放，这意味着整体状况下腧穴成纤维细胞的胞膜磷脂结构在针推压力的刺激作用下也可能发生改变，启动PGs的合成，从而将机械刺激信号转换为生物化学信号；②由于PGE2可以抑制血小板凝集，扩张局部小血管，促进局部血液循环，因此笔者认为，该机制可能是针推疗法(物理性治疗手段)本身具有“活血化瘀”功效的基本生物学原理之一；③PGs合成一旦启动，其具体合成哪一种则取决于当时的生理需要，笔者推测，这和针推治疗效应与机体当时生理状态有关的作用规律可能存在某种内在的必然联系。

(3)压力刺激促进腧穴成纤维细胞IL-6合成释放的意义

IL-6的生物学作用广泛，在免疫方面：IL-6能诱导B细胞增殖、分化和产生抗体，能促进T细胞在胸腺的生长与细胞毒性T细胞分化成熟，并诱导其活性发挥，刺激肝细胞产生急性期反应蛋白，引起发热；在血液方面：IL-6具有刺激机体血液生成系统，发挥造血作用；在神经系统方面：IL-6能对抗神经损伤，促进神经元的存活，促进和保护受损神经元及轴突的再生，诱导神经元分化，加强神经内Ca2+反应，调节神经递质合成，刺激星形细胞增殖，刺激丘脑下部一垂体一肾上腺皮质轴和诱导发热，并对疼痛进行调节。

由于PGE2在体内不稳定，远距离传递的过程中容易失去生物活性，故只能起到局部不同组织之间信息传递的作用和局部治疗的效应，因此它的治疗学意义可能小于它作为信号分子的意义，更多的是为腧穴其他特定组织诸多功能的启动营造一个适宜的局部生化环境。而IL-6不同，IL-6作为一种可以由力学刺激而诱导产生的生物活性蛋白，在体内，其生物活性相对稳定，既能作用于穴区局部，起到局部不同组织间的信号传递作用(自分泌和旁分泌作用方式)，又能通过某种途径作用于远端组织器官甚至全身(内分泌作用方式胡)，发挥远治效应，所以IL-6的治疗学意义同样巨大。如果IL-6作用于局部与远端的神经组织，发挥神经营养作用，对抗神经损伤，调节神经感受功能等，笔者认为这些生理作用的发挥，也许就是为什么针推治疗能够治疗多种神经系统方面疾病的潜在机制之一；另外，IL-6的免疫增强作用和刺激造血作用似乎也正体现了腧穴筋膜组织在机械力刺激下发挥“蠲邪扶正”治疗效应的现代医学生物学原理。

(收稿日期：2006-06-02，齐淑兰发稿)

注：本文所涉及到图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文