白英甾体皂苷组分抗肿瘤作用初步研究

摘 要：目的：探讨白英甾体皂苷组分的抗肿瘤作用及其作用机制。方法：采用MTT法观察白英甾体皂苷组分体外对人卵巢癌细胞SKOV3及人宫颈癌细胞ME180的增殖抑制作用、检测LDH漏出率观察白英甾体皂苷组分对人卵巢癌细胞SKOV3的杀伤作用。结果：白英甾体皂苷组分能显著抑制SKOV3、ME180的生长，低浓度下对人正常细胞CCC-HPF-1无明显抑制作用，作用于SKOV3时LDH漏出率显著增加。结论：白英甾体皂苷组分能引起肿瘤细胞的坏死，具有抗肿瘤的作用。

关键词：白英甾体皂苷组分；抗肿瘤；坏死

中图分类号：R285.5文献标识码：A

文章编号：1673-7717(2008)05-0930-02

Primary Study on Anti-tumor Effect and Mechanism of Monomer of Solanum Lyratum

YAN Jie1，PAN Ruile2,TANG Jinle3,LUO Jing1,HE Kaiyi1,HU Qin2,PENG Bo2,LIU Xinmin2

(1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410007,Hunan,China;2.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100094,China;3.Institute of Medical Physical and Engineering,Qinghua University,Beijing 100084,China)

Abstract:Objective:To study the anti-tumor effect and the mechanism of the monomer of Solanum lyratum. Methods:The anti-tumor effect of the monomer of Solanum lyratum was studied by MTT assay,LDH release assay.Result: It's significant that the monomer of Solanum lyratum can inhibit the growth of the SKOV3 and ME180,moreover it is no significant inhibition on human normal cell ccc-hpf-1 that the monomer is in low concentration.LDH's release increased. Conclution:The monomer of Solanum lyratum can evoke the necrosis of tumor cells，it has the effect of anti-tumor.

Keywords:monomer of Solanum lyratum；antitumor；necrosis

白英（Solanum lyratum Thunb.），别名白毛藤、毛风藤，是我国传统的具有清热解毒、利湿消肿作用的中药。《本草拾遗》中记载白英的功效为：“主烦热，风疹，丹毒，疟瘅，寒热，小儿结热。”现代研究证明，白英水提物、醇提物和脂溶性提取物[1-3]具有强有效的抗癌、防癌作用。本研究将白英甾体皂苷组分体外作用于肿瘤细胞，旨在探讨白英甾体皂苷组分作为妇科肿瘤预防和治疗剂的可行性，为临床开发新的抗癌药物提供基础。

1 材 料

1.1受试样品 白英甾体皂苷组分，由中国医学科学院药用植物研究所提供。取白英生药1kg，先用90%乙醇冷浸提取3次，每次溶剂1L，24h，过滤；滤渣再用50%乙醇同法提取2次，过滤，合并滤液，浓缩至一定体积，用150g硅胶吸附，然后采用硅胶柱粗分离，用氯仿-甲醇（100∶0~0∶100）梯度洗脱，收集6个部分，经活性检测，氯仿-甲醇(40:60)洗脱部分具有较好的抗肿瘤活性。该部分再用硅胶柱分离，氯仿-甲醇（8∶2）洗脱，每份500，收集11~13份，经凝胶层析得白色粉末，经核磁共振碳谱、氢谱检测，该粉末为以替告皂苷元为母核的皂苷类化合物的混合物。使用时用DMSO溶解。

1.2试剂与仪器 RPMI1640培养基（Gibco），胎牛血清（Gibco），四甲基偶氮唑蓝（MTT,Sigma），DMSO(北京拜尔迪生物技术有限公司)，紫杉醇注射液（北京四环医药科技股份有限公司，批号0610231），Caspase-3、Caspase-9分光光度法检测试剂盒（北京天来生物医学科技有限公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京骏腾兴业生物科技有限公司），乳酸脱氢酶试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司），酶标仪（BioRad 680型），紫外分光光度计（Unico），流式细胞仪（美国Coulter公司EPICS XL型），倒置显微镜（美国Olympus）。

1.3细胞株 人卵巢癌细胞SKOV3（由中国医学科学院药用植物研究所提供）,人宫颈癌细胞ME180，人胚肺二倍体细胞CCC-HPF-1（由中日友好医院提供）

2方 法

2.1MTT[4]法检测白英甾体皂苷组分的体外增殖抑制作用

取对数生长期的细胞，稀释至2.0×104/mL，以每孔100μL接种于96孔板中。37℃、5％CO2条件下培养12h后加白英甾体皂苷组分，设3、7.8、12.4、19.7、32.4μg/mL5个浓度,同时设阳性对照组（20μg/mL紫杉醇），溶剂对照组（0.23％DMSO），空白组（无血清1640培养基），每组6个复孔，每孔终体积为200μL。分别培养1、2、3、4、5天后每孔加10μL MTT（0.5％），继续孵育4h后弃上清，各孔加150μL DMSO，震荡10min待结晶溶解，在酶标仪570nm波长处测定吸光值，计算出抑制率和半数抑制浓度（IC50）。

增殖抑制率＝（1-实验组平均OD值÷溶剂对照组平均OD值）×100%

2.2 紫外分光光度法测试SKOV3的LDH漏出率

取96孔板，收集白英甾体皂苷组分作用后SKOV3细胞上清，设置空白组，在去除上清的孔中加入0.1％的Triton-100,于37℃、5％CO2条件下继续孵育30min后取裂解液。将待测液（细胞上清或裂解液）LDH工作液在比色杯中混合,反应30s后读取初始吸光值，同时开始计时，在精确1、2、3min时分别读取吸光度，确定每分钟平均吸光度变化（ΔOD/min），将蒸馏水与工作液混合作为参比。根据试剂盒所提供公式计算LDH酶活浓度，再计算出漏出率。

LDH-L(U/L)=(ΔOD样品/min－ΔOD参比/min）×F

F＝934.7443

LDH漏出率= LDH-L上清/（LDH-L上清+ LDH-L裂解液）×100%

3 结 果

3.1白英甾体皂苷组分的体外增殖抑制作用

白英甾体皂苷组分对卵巢癌SKOV3细胞和宫颈癌ME180细胞均有较强的增殖抑制作用，其IC50均低于人胚肺二倍体细胞CCC-HPF-1的1/3，而对SKOV3的作用又更为敏感，其IC50在4.51~7.78μg/mL之间（表1）。对SKOV3的抑制作用随白英甾体皂苷组分浓度的增加而逐渐增加，作用4天后生长抑制最明显（图1），对ME180的作用呈良好的时间-浓度依赖性（图2）。12.4μg/mL以下浓度的白英甾体皂苷组分对于人体正常细胞CCC-HPF-1无明显抑制作用，12.4、19.7μg/mL对CCC-HPF-1的抑制率明显低于SKOV3和ME180（P0.05）（图3）。可见白英甾体皂苷组分对SKOV3和ME180较正常的CCC-HPF-1有很强的选择杀伤活性。

3.2 LDH漏出率

经白英甾体皂苷组分处理后，7.8、12.4、19.7μg/mL组在48h、72h的LDH漏出率明显高于正常组（P0.05)，在72h有较明显升高（P

4 讨 论

白英是我国传统的具有清热解毒，利湿消肿作用的中药，现代研究表明白英还具有强有效的抗癌、防癌作用，体内外实验发现白英水体物、醇提物、脂溶性提取物以及含有白英的复方均有良好的肿瘤抑制作用。白英甾体皂苷组分作为从白英中提取的化合物能够选择性的抑制体外培养的SKOV3和ME180生长。

细胞死亡的方式通常为凋亡和坏死，凋亡细胞因为始终有细胞膜的封闭，因此没有内容物的释放，而坏死细胞由于细胞膜破裂，细胞内容物大量流出。LDH是存在于所有细胞中的一种稳定的酶，当细胞破膜坏死时会迅速释放到细胞外，细胞质内LDH减少，培养液中LDH增加，因此LDH漏出率是细胞坏死与否的重要标志[5]，漏出率越大细胞膜通透性越高，细胞坏死越严重。3~19.7μg/mL B-1作用48、72h后LDH漏出率显著增加，明显高于空白组。可见白英甾体皂苷组分可导致肿瘤细胞坏死。

综上所述，白英甾体皂苷组分能够引起肿瘤细胞的坏死，具有良好的抗肿瘤作用，这些为进一步研究白英甾体皂苷组分抗肿瘤的机制提供了一定的实验依据。

参考文献

［1］ 尹礼烘.白英诱导人肺癌SPC-A-1细胞凋亡试验研究［D］.江西医院硕士研究生毕业(学位)论文，2005.

[2] 任靖,冯国楠,王敏伟.白英总苷抗肿瘤作用初步研究［J］.肿瘤防治研究，2006，33(4):262－264.

[3] Chang-Min Shan, Juan Li. Study of apoptosis in human liver cancers［J］.World J Gastroenterol，2002，8(2):247-252.

[4] 李家宁,吕福祯,肖金玲.大黄素对人肺腺癌细胞Anip973 增殖周期及凋亡基因的影响［J］.中国中西医结合杂志,2006,26(11)∶1015-1017.

[5] Elena V Komissarova, Sam K Saha, Toby G Rossman. Dead or dying:theimportance of time in cytotoxicity assays using arsenite as an example［J］. Toxicology and Applied Pharmacology,2005，202：99-107.