含朱砂的万胜化风丹和氯化汞对大鼠肾转运体、肾汞蓄积和Kim―1表达的影响

[收稿日期] 2013-10-31

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81160415）；贵州中药现代化专项（2010-5）；药物代谢平台项目（新药药理与毒理023）；研究生教育创新基地（黔科 2008-002）；遵义医学院博士启动基金（F-582）

[通信作者] *陆远富，教授，博士，研究生导师，主要从事药物代谢与药物毒理研究，Tel：（0852）8609623，E-mail：

[作者简介] 朱琼妮， 硕士研究生，E-mail：

[摘要] 研究含朱砂的万胜化风丹（WSHFD）和氯化汞对SD大鼠肾汞摄取转运体（Oat1， Oct2），肾汞外排转运体（Mrp4， Mate2k）、肾汞蓄积和肾损伤分子1（kim-1）的影响。发现含汞10倍量的万胜化风丹古方对大鼠肾汞蓄积及肾毒性远小于HgCl2，且其对肾转运体的作用小于HgCl2。而上述各指标在WSHFD0，WSHFD2和WSHFD3组无显著差异，表明在万胜化风丹中减量或去掉朱砂对其肾汞蓄积和肾毒性影响不大。

[关键词] 万胜化风丹； 氯化汞； 肾汞； 肾转运体； Kim-1

含朱砂的万胜化风丹曾是受保护的四大名药之一，由天麻、僵蚕、全蝎、天南星、荆芥、紫苏叶、苍术、雄黄、药母、麝香、檀香、朱砂、硼砂、巴豆霜、冰片等15味中药经独特的下窖发酵及风干工艺制作而成，用来治疗中风等疾病[1]。古方万胜化风丹含朱砂约为10%，朱砂为含汞化合物，其毒性备受人们关注[2-3]。近年来根据药典规定将朱砂用量减少约2/3，称为现代配方[4]。2013年5月，同仁堂40余种中成药因含朱砂（汞）超标，被香港卫生局禁售。但在中国大陆的中药店里，含朱砂的中成药比比皆是。含朱砂的中药真有那么毒吗？不含朱砂或将朱砂减量的万胜化风丹毒性会减少吗？肾脏是无机汞毒性的主要靶器官，故本实验用高于临床用量的万胜化风丹古方（WSHFD3），减量方（WSHFD2）和不含朱砂的方药（WSHFD0）与HgCl2（约10%古方汞量）口服给药1周，比较其肾汞蓄积，肾转运体及肾脏毒性基因表达，为含朱砂的万胜化风丹的安全用药提供毒理实验基础。

1 材料

1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠，体重（180±40） g，由重庆市第三军医大学提供，许可证号SCXK（渝）2012-005，饲养于清洁级动物中心，合格证号SYXK2011-004，适应1周后给药。

1.2 药品与试剂 万胜化风丹古方药，现代配方和不含朱砂的方药由贵州省万胜制药有限公司提供。氯化汞（美国Sigma公司）；Trizol，PCR引物[宝生物工程（大连）有限公司]；High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits（美国Applied Biosystems公司）； iQTM SYBRGreen SuperMix（美国BIO-RAD公司）；mRNA纯化试剂盒（上海华舜生物技术有限公司）。

1.3 仪器 KCHG AFS-230E AFS双通道原子荧光光谱仪（北京科创海光）；实时荧光定量PCR仪（美国BIO-RAD）；多功能梯度PCR仪（德国Eppendorf）；全波长酶标仪（美国Thermo）；5417R型冷冻离心机（德国Eppendorf）；X-15R型冷冻离心机；Icycler IQ型实时荧光定量PCR仪（美国BIO-RAD公司）。

2 方法

2.1 动物分组与给药 30只雄性SD大鼠随机分为5组，每组6只：万胜化风丹不含朱砂组（WSHFD0，1.5 g・kg-1）、万胜化风丹现代配方组（WSHFD2，1.5 g・kg-1，含Hg 45.3 mg・kg-1）、万胜化风丹原方组（WSHFD3，1.5 g・kg-1， 含Hg 129.3 mg・kg-1）、氯化汞（HgCl2，18 mg・kg-1，含Hg 13 mg・kg-1）。氯化汞组含汞量约为古方组的10%。各组口服灌胃给药连续7 d，空白对照组给予等体积双蒸水。

2.2 肾指数测定 大鼠处死取出肾脏后，立即用滤纸擦干表面残血，称重，以相应质量计算出肾脏指数。肾脏指数=肾脏质量（mg）/体重（g）×100。

2.3 肾组织中汞蓄积量测定 称取约100 mg肾组织于消化罐中，加入5 mL浓硝酸，180 ℃烘箱中消化2 h，取出后用去离子水定容至50 mL。在贵州省理化测试中心用双通道原子荧光光度计进行检测。标准曲线的绘制方法同上，分别吸取10 mg・L-1的汞标准液稀释至0，2，4，6，8，10 ng・kg-1后立即进行测定。标准曲线Y=105.500X+4.933，r=0.998 3。

2.4 Real-time PCR检测相关基因的表达 取肾组织50～100 mg于1 mL Trizol中，提取肝脏总RNA，测定其浓度及纯度，按照试剂盒说明书提取并纯化RNA， 并分别在260，280 nm处测其吸光度，A260/A280均在1.8～2.0。逆转录为cDNA后进行聚合酶链反应。以GAPDH为参照，引物序列见表1。用相对量法计算肾损伤相关基因Kim-1，MT-1，MT-2及转运体相关基因Oct2，Oat1，Mate2k，Mrp4 mRNA的表达水平。以Ct为统计参数，采用目的基因及GAPDH相对含量的比值作为评价标准，对实验中目的基因进行相对定量。

2.5 统计学处理 实验数据以±s表示，应用SPSS 17.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齐采用LSD法检验，方差不齐则采用Dunnett′s法检验，P

3 结果

3.1 肾指数测定 连续7 d给药后，相当于10%古方组（WSHFD3）含汞量的氯化汞组肾指数增大30%，与对照组比有显著性差异（P

3.2 肾组织中汞蓄积量测定 古方万胜化风丹以略高于临床量灌胃大鼠1周后，其大鼠肾汞蓄积远低于氯化汞。与对照组相比，HgCl2组肾组织中汞蓄积量明显升高（45 vs 1 μg・g-1肾组织）（P

与对照组相比较1）P

图1 万胜化风丹各组及HgCl2组肾汞含量

Fig.1 Kidney mercury （Hg） contents of Wansheng Huafeng Dan groups and HgCl2 group

3.3 肾损伤基因Kim-1 mRNA的表达 作者前期的研究表明用相同剂量的万胜化风丹古方给药3周未见明显肾损伤及血尿素氮（BUN）、血肌酐（CREA）的增高[6]，因此选择更为敏感的早期指标。Kim-1是肾小管损伤的最敏感的生物标志。Timmeren等认为，在肾脏疾病患者中，Kim-1在肾小管细胞表达增加并与肾损伤程度密切相关。本实验中与对照组相比，HgCl2组肾组织中Kim-1明显高于对照组25倍，而汞含10倍量的万胜化风丹古方和其余各组与对照组无明显差异。Kim-1在WSHFD0，WSHFD2和 WSHFD3组无显著差异（图2）。

图2 万胜化风丹各组及HgCl2组肾损伤基因Kim-1的表达

Fig.2 The expression of kidney injury molecule-1（Kim-1） in the groups of Wansheng Huafeng Dan and HgCl2

3.4 肾MT-1，MT-2 mRNA的表达 HgCl2可诱导MT-1 和MT-2的表达，与对照组相比，HgCl2组肾MT-1 和MT-2的表达升高约4倍。而含汞3～10倍量的万胜化风丹各组与对照组相比无明显差异。 MT-1和MT-2在WSHFD0，WSHFD2和WSHFD3组无显著差异（表3）。

3.5 肾Oct2和Oat1 转运体mRNA的表达 与对照组相比，HgCl2组肾转运体Oct2的表达降低3.56倍，而含汞10倍量的万胜化风丹古方和其余各组与对照组相似，无明显差异。肾转运体Oat1 在HgCl2组的表达比对照组降低2.31倍，而WSHFD0，WSHFD2，WSHFD3组Oat1表达变化不明显（图3）。

图3 万胜化风丹各组及HgCl2组对肾Oct2和Oat1的表达

Fig.3 The expression of organic cation transporter-2 and organic anion transporter-1 in the groups of Wanheng Huafeng Dan and HgCl2

3.6 肾Mate2k和Mrp4 转运体mRNA的表达 HgCl2可以升高肾脏外排转运体Mate2k及Mrp4，其表达量为对照组的3～4倍，而其余各组与对照组相比较差别不明显。 Mate2k和Mrp4在WSHFD0，WSHFD2和WSHFD3组中的表达无显著差异（图4）。

4 讨论

朱砂常被当作HgCl2来作安全性评价[5，7]。本研究发现含汞10倍量的万胜化风丹古方及其他各万胜化风丹组的肾汞蓄积，肾损伤生物标志Kim-1和肾摄入转运体Oat1，Oct2 表达均小于氯化汞组，而氯化汞组肾外排转运体Mate-2k和Mrp4的表达均高于其余各组。说明朱砂在体内处置过程与HgCl2不同，其原因可能是因为朱砂与氯化汞化合物形式不同，而导致吸收、分布和排泄上的差异，进而导致其肾毒性差异。而上述各指标在WSHFD0，WSHFD2和WSHFD3组无显著差异，表明在万胜化

图4 万胜化风丹各组及HgCl2组对肾Mate2k和Mrp4的表达

Fig.4 The expression of Mate2k and Mrp4 in the groups of Wansheng Huafeng Dan and HgCl2

风丹中减量或去掉朱砂对其肾汞蓄积和肾毒性影响不大。

目前对汞的含量评估主要以其总汞含量为标准[3]。近年来的工作已清楚表明用总汞来评价朱砂安全性欠妥[3，5-8]。万胜化风丹含朱砂，因其古方中汞含量超标而减量，但减量后的万胜化风丹虽达到药典标准，仍超过国际标准上千倍。且药效下降，销售量骤降。就急性毒性而言，含朱砂的万胜化风丹在相当于临床用量的7.5倍 （3 g・kg-1） 的剂量下，一次性小鼠给药未见明显肝肾毒性[4]。相比之下，氯化汞则引起肝、肾汞的明显蓄积和病理损伤[4]。用临床等量的朱砂（0.42 g・kg-1），连续给药3周，未见明显肝、肾、脑汞蓄积和肝肾毒性[6]，对汞毒性敏感基因MT的诱导和对Cyp2e1的抑制则远低于氯化汞 （20 mg・kg-1） 和甲基汞（1 mg・kg-1）[6]。大鼠万胜化风丹的临床等效量为0.42 g・kg-1，Hg含量 40 mg・kg-1[6]。本实验用3倍于临床剂量（1.5 g・kg-1）是为和其急性毒性相比较[4]，各万胜化风丹组（1.5 g・kg-1）连续给药1周后，发现给药各组与氯化汞组（18 mg・kg-1）汞蓄积量完全不同，其肾毒性也完全不同。WSHFD0，WSHFD2和WSHFD3组的肾汞蓄积量无显著差异，也未见明显肾毒性，进一步说明朱砂与氯化汞是不能相提并论的， 在此剂量和1周用药的条件下，其吸收和分布远远低于氯化汞， 且差异不明显。 但如高剂量和慢性用药（2个月以上），WSHFD0，WSHFD2和WSHFD3组的肾汞含量是有差异的，但不是决定其肾毒性的唯一因数。

在亚急性的汞暴露试验中，血生化和病理改变不是敏感的指标[6]。研究发现肾脏损伤分子（kidney injury molecule 1，Kim-1） 在汞引起的肾损伤中很敏感[9]，其高表达先于病理和血生化的变化。是一种检测早期肾损伤的可靠生物学标记[10]。在本试验中，氯化汞组的肾指数高于其他各组30%，提示肾脏的异常，但最有说服力的是25倍升高的Kim-1。 因此，Kim-1可望用来在临床和基础试验中评价含朱砂中药对肾脏的损伤的敏感指标 [9-10]。

MT是富含半胱氨酸的金属结合蛋白，很容易被汞诱导产生，其巯基能强烈螯合有毒金属，使其成为无毒物质，并将之排出体外，从而实现解毒，保护肾脏免于汞毒损伤。MT的诱导也可用来作为汞急性毒性[4]、亚急性毒性[6]和慢性毒性[9]的生物标志。在本研究的实验条件下，去朱砂的万胜化风丹组和减朱砂量的万胜化风丹组，其MT的表达与对照无差异。古方万胜化风丹组略有升高（55%），但不显著，对比之下，氯化汞增加约4倍。因此MT也可望用来作为在临床和基础试验中来评价含朱砂中药对肾脏的损伤的指标之一[4，6，9]。

目前发现肾脏含至少37种转运体，可分为摄取和外排等4类[11]不同的转运体。其中基底侧膜转运体介导Hg的吸收。有研究表明在MDCK细胞中Oat1介导Hg+2结合物的吸收，稳定的转染Oat1的MDCK细胞内HgCl2和甲基汞累积增加，导致毒性增加[12]。 而作者灌胃给药7 d后，发现HgCl2组能降低Oat1的表达，且其表达量低于空白组的2.31倍。Oct2作为肾脏中表达丰富的一种肾脏转运体，其与许多有机阳离子药物的转运有着密切的关系，给药7 d后Oct2的表达也降低3.56倍。摄入转运体在给药7 d后表达的下降，这可能是为了防止汞吸收到细胞的自适应机制[13]。

肾脏外排转运体介导化学毒物的外排到尿液，是防止汞的蓄积和汞毒性的一个重要机制。多药耐药蛋白转运体Mrps介导汞的外排，Mrp2缺陷大鼠注射给予HgCl2和甲基汞，在尿液中检测到的汞含量减低[12，14]。Mate2k是肾脏的外排转运体，主要介导药物和毒物外排[15]。 发现HgCl2可诱导Mrp4和Mate2k表达增加3～4倍，而其他组则变化不明显。这也说明氯化汞的肾毒性与肾脏转运体有关。而上述各转运体的表达在WSHFD0，WSHFD2和WSHFD3组无显著差异，说明去朱砂和减少朱砂在万胜化风丹的配方中对减少其肾毒性无明显意义。但大剂量、长期给予万胜化风丹其肾毒性及其毒性机制有何不同，需要更进一步研究。

综上所述，含汞10倍量的万胜化风丹的肾汞蓄积量远远小于氯化汞。肾Kim-1的表达是评价汞对肾脏的损伤的敏感指标， 而肾转运体与氯化汞的肾蓄积有关。

[参考文献]

[1] 郑曙光，缪美淑. 化风丹治疗癫痫病临床观察[J]. 贵阳中医学院学报，1996，18 （1）：54.

[2] Liu J， Shi J Z， Yu L M， et al. Mercury in traditional medicines：is cinnabar toxicologically similar to common mercurials？[J]. Exp Biol Med， 2008， 233：810.

[3] 张永文，马秀，阳长明. 含朱砂、雄黄的中药制剂的质量控制及安全性评价问题分析[J]. 中国中药杂志， 2010，35（11）：1501.

[4] 颜俊文，苗加伟，何海洋，等. 万胜化风丹、雄黄、朱砂与无机砷、汞化合物的的急性肝肾毒性作用[J]. 中国药理毒理学杂志，2011，25（4）：380.

[5] 刘竹兰，王翠玲，刘建利. 硫化汞-朱砂的有效成分[J]. 西北大学学报，2008，38（3）：428.

[6] 彭芳，杨虹，吴芹，等. 万胜化风丹对大鼠亚急性毒性的研究[J]. 中国中药杂志，2012，37（3）：1017.

[7] 周昕睿，王旗，杨晓达. 朱砂的药理及毒理机制研究进展[J]. 中国中药杂志，2009，34（22）：2843.

[8] 陆远富，时京珍，石京山，等. 科学评价含雄黄、朱砂中成药的安全性[J]. 中国中药杂志， 2011，36 （24）：3402.

[9] Shi J Z， Kang F， Wu Q， et al. Cinnabar-containing Zhu-Sha-An-Sheng Wan is much less chronically nephrotoxic than mercury chloride and methylmercury in rats [J]. Toxicol Lett， 2011， 200：194.

[10] 赵宇，樊恒，包蓓艳. 肾损伤分子1与lgA肾病关系的研究进展[J]. 医学综述，2012，18（21）：3548.

[11] Klaassen C D， Aleksunes L M. Xenobiotic， bile acid， and cholesterol transporters：function and regulation[J]. Pharmacol Rev， 2010， 62：1.

[12] Zalups R K， Ahmad S. Transport of N-acetylcysteine s-conjugates of methylmercury in Madin-Darby canine kidney cells stably transfected with human isoform of organic anion transporter 1[J]. J Pharmacol Exp Ther， 2005， 314：1158.

[13] Di Giusto G， Anzai N， Ruiz M L， et al. Expression and function of Oat1 and Oat3 in rat kidney exposed to mercuric chloride[J]. Arch Toxicol， 2009，83：887.

[14] Bridges C C， Joshee L， Zalups R K. MRP2 and the handling of mercuric ions in rats exposed acutely to inorganic and organic species of mercury[J]. Toxicol Appl Pharmacol， 2011， 251：50.

[15] Tanihara Y， Masuda S， Sato T， et al. Substrate specificity of MATE1 and MATE2-K， human multidrug and toxin extrusions/H（+）-organic cation antiporters [J]. Biochem Pharmacol， 2007， 74：359.