棕色棉色素液分离

天然彩色棉是在生长过程中能合成天然色素的棉花品种，目前报道的彩色棉有棕、绿、黑、红、蓝、粉、土黄、浅灰等多种颜色［1－2］，但仅有棕、绿色2种棉因其较好的纤维品质和较高的产量而成功投入市场［3］。彩色棉产品无需染色，加工过程力求采用生态的方法，具有环保、附加值高等优点，但是在加工和服用过程中，彩色棉(特别是绿色棉)存在色泽不稳定的现象［4－6］，归结原因可能是色素变性所致。只有明确彩色棉色素的成分和结构，才能探究其色变机制以选择合适的加工工艺防止色素变性、固定以及修复色素。目前，绿色棉的色素被认为主要是黄酮类，而棕色棉的色素并不是十分确定，可能为黄酮类或是缩合单宁氧化成的醌类化合物［7－8］。固液色谱体系是目前天然产物分离中应用最为广泛的方法，其中反相柱色谱和分子排阻色谱为样品最终分离中最为常见的手段。本文尝试首先利用聚酰胺柱对棕色棉色素进行分段富集，然后采用反相C18柱对富集后的色素进行最终分离，以期建立棕色棉色素分离的方法，为色素分子的结构鉴定奠定基础。

1实验部分

1.1材料及仪器材料:普通白色棉纤维、天然棕色棉纤维(浙江省农业科学院提供的彩选系列)。试剂:无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、乙酸、丙酮、氨水、尿素，均为分析纯。高效液相色谱洗脱剂:甲醇为色谱纯，水为超纯水。仪器:JK-2200D型数控超声波清洗器，R201D型旋转蒸发仪，GL-16G-Ⅱ型冷冻干燥机，Agilent1100高效液相色谱仪及HypresilBDSC18色谱柱(4.0mm×125mm，4.5μm)，自填HypresilC18制备柱(3.5mm×120cm，50μm)，EC-2000色谱工作站(包括WellchromK-1800泵、LabAllianceModel500紫外检测器、FRC210A分步收集器、Rheodyne7725i手动进样阀)，自填聚酰胺柱(10cm×30cm，75μm)(聚酰胺粉购自台州四甲生化塑料厂)。

1.2方法1.2.1色素的提取与纯化分别将棕色棉纤维和普通白色棉纤维粉碎，称取10g纤维粉末分别放入容量瓶中，按料液比1∶100(质量/体积)加入70%乙醇，于60℃、70W下超声波辅助萃取1h，抽滤2次，收集提取液，并用旋转蒸发仪50℃将提取液浓缩至溶液浑浊。将浓缩后的提取液转入分液漏斗，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取3次去除脂溶性杂质，将除杂后的棕色棉色素水溶液冻干、称量并置于－10℃下保存。

1.2.2色素提取物的高效液相色谱分离将稀释后的棕色棉和白色棉提取液过4.5μm微孔滤膜并按如下色谱条件进行分离:柱温为30℃，流速为0.5mL/min，进样量为10μL，检测波长为280nm。流动相为甲醇(A相)和0.5%的乙酸水溶液(B相)，采用梯度洗脱，流动相配比:0～6min，4%A;6～20min，4%～100%A;25min，100%A。

1.2.3色素的聚酰胺柱精制取1g初步纯化后的棕色棉色素粉末溶解于20mL蒸馏水中并将色素溶液沿管壁加在聚酰胺柱上端，待色素吸附平衡后加足量蒸馏水洗脱至流出液无色，依次用50%丙酮、pH=9的氨水、0.3%的尿素水溶液洗脱，得到4个流分的色素溶液。将各流分浓缩、冻干、称量并置于－10℃下保存。按1.2.2色谱条件检测各流分成分。

1.2.4色素的反相C18制备柱分离分别取100mg各流分色素粉末加15mL蒸馏水溶解，经4.5μm微孔滤膜过滤后注入进样器。流动相分别为:0～120min，5%甲醇(纯水流分);0～180min，25%～70%甲醇(其他流分)。流速均为6mL/min，每2min收集1管。按1.2.2色谱条件检测收集成分的纯度。

2结果与分析

2.1色素提取物的高效液相色谱分离分析先前的提取实验发现棕色棉的水提取液颜色较深，甲醇、乙醇提取液颜色很浅，而乙酸乙酯、丙酮等中极性溶剂以及氯仿等弱极性溶剂的提取液均为无色，这初步说明棕色棉色素属于极性水溶性化合物。棕色棉纤维与白色棉纤维的提取液经减压浓缩后，分别呈红棕色和淡黄色，棕色棉色素溶液经石油醚和乙酸乙酯多次萃取后，色素溶液变澄清，颜色也明显加深，3次萃取后，石油醚萃取液中仍可看到少量白色的絮状物质，可能为糖类、蛋白质类杂质。2种棉纤维提取液的反向HPLC分离结果如图1所示。白色棉纤维的提取液仅有1种成分，其保留时间为2.00min，棕色棉纤维的提取液中成分较杂，主要分为2部分:0～6min的强极性部分，主要有保留时间为1.49(成分1)、2.41(成分2)、3.23(成分3)和4.37min(成分4)的4种物质;以及10～20min的保留时间跨度较大，峰形较差的部分。2种纤维提取物中并无化学结构一致的成分。经初步纯化后，棕色棉纤维提取物中杂质明显变少，保留时间为4.37min的成分被大致去除。

2.2色素的聚酰胺柱精制分析具有一定量的纯品是分子结构鉴定的基本要求，提取物中的成分往往很杂而且目标成分的含量很低，这既增加了目标成分分离的难度，也降低了分离效率，所以在分离工作进行前对样品进行分段富集十分重要。聚酰胺适用于对多酚类化合物的纯化，其用于分离纯化黄酮类、低聚单宁类有较多成功的例子［9－10］。聚酰胺与样品的结合为氢键吸附，样品芳香化程度越高，酚羟基越多则吸附越强。各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力大小依次为水、甲醇、丙酮、碱水溶液、甲酰胺、尿素水溶液。图2为聚酰胺柱对棕色棉色素分段富集后HPLC图。纯水洗脱的色素部分呈橙色，这部分色素与聚酰胺之间的结合力很弱，很可能为小分子的多酚类化合物。50%丙酮、pH=9的氨水、0.3%的尿素水溶液依次洗脱下色素均呈暗棕色，经HPLC检测，发现各部分的保留时间和峰形大致相同，均对应于色素粗品的10～20min段。该部分色素与聚酰胺的吸附非常强且在HPLC图中仅有1个时间跨度很长的洗脱峰，从这2个特点看，这3部分很可能是由芳香化程度不同但结构十分相似的一族化合物组成。除了这4部分色素外，还有少部分色素与聚酰胺发生死吸附而未能洗脱下来，经冻干后得到的这4部分色素的质量分别为184.2、167.5、426.1、114.7mg。

2.3色素的反相C18制备柱分离分析十八烷基键合硅胶是制备柱最常用的固定相，适用范围较广，其流动相一般为甲醇水体系，特殊情况下会使用洗脱能力稍强的乙腈水体系。聚酰胺柱上纯水洗脱部分的C18制备液相色谱图如图3所示。成分1和成分2的洗脱峰之间的分离度较小，分离效果较差，成分3的分离也受到其他微量成分的影响，但得到符合纯度要求的该成分要较前2种成分容易。图4示出分离所得纯品的HPLC检测结果。3种所得产品用面积归一化法定量，纯度均大于98%。成分1与成分2均为橙色，二者的紫外光谱十分相似(如图5所示)，可能为结构相似的化合物。成分3为无色，在230、290nm左右有较强的吸收峰，将该成分的洗脱液浓缩并滴加FeCl

3水溶液，没有明显的显色现象发生，由此可知该成分不属于酚类物质，与棕色棉色素的成分并无关系。明确3种分离产品具体的分子结构还有赖于对其质谱与核磁共振图谱的解析。由于棕色棉色素的分子极性大，在反相柱上的保留效果差，该部分色素需要经过数次分离—合并—浓缩—再分离的过程才能得到少量满足要求的纯品。与分析型C18柱一样，制备型C18柱也不能使50%丙酮、pH=9的氨水、0.3%的尿素水溶液富集的色素分离，其制备液相色谱图均只有1个保留时间跨度很大的洗脱峰，这3部分的洗脱液经HPLC检测，发现峰形均一致且与未经分离前的图大致相同。结合棕色棉色素的溶解性能以及在聚酰胺柱、分析型C18柱和制备型C18柱上的保留行为，以及与文献［11－12］所记载的缩合单宁类的HPLC图比较，本文认为棕色棉色素更可能为缩合单宁或其氧化物。由于棕色棉色素的分子极性大，其与亲脂性的C18键合硅胶相之间的吸附力太弱，导致色素分子在反相柱上难以保留而不易有效分离。另一方面，由于缩合单宁类为分子结构十分相似一类黄烷醇聚合体，随着聚合度增加，不同聚体间的极性差异更小，这也使得主要依靠样品极性差异获得分离的吸附型色谱无能为力。分子排阻色谱的流动相选择范围广，分离的原理主要基于样品的分子尺寸大小。目前，使用以SephadexLH-20为固定相，丙酮水为流动相的体系最高可以分离到缩合单宁的五聚体［12］，该色谱体系可能更适合分离棕色棉色素这类极性化合物，但其对棕棉色素的分离有待进一步研究。3结论以聚酰胺吸附剂，蒸馏水、50%丙酮、pH=9的氨水、0.3%的尿素水溶液为洗脱剂的柱层析体系可以有效将棕色棉色素提取物分段富集。采用反相C18制备柱分离了聚酰胺柱上的水洗脱部分，成功得到了2种有色成分和1种无色成分，但是反相C18制备柱不能将其余3部分富集产物有效分离。结果表明，天然棕色棉色素具有亲水性，而且结构复杂，很可能并不是一种单一的组分，而是由一系列结构相似的同系多酚类化合物组成。