血清神经元特异性烯醇化酶免疫放射分析药盒的改进

【摘 要】血清神经元特异性烯醇化酶（Neuron-specific enolase，NSE）免疫放射分析药盒为我公司现有产品，主要用于检测血清中神经元特异性烯醇化酶含量，监测小细胞肺癌患者的病情发展，并对治疗效果进行评价。原有药盒存在灵敏度较低、反应时间过长及最大结合率偏低等问题。本项工作通过对包被方法、标记方法及分析程序等条件进行优化，提高了药盒相关参数指标，使之更好的应用于临床检验。

【关键词】血清神经元特异性烯醇化酶；免疫放射分析；改进

神经元特异性烯醇化酶（Neuron-specific enolase，NSE）是参与糖酵解途径的烯醇化酶中的一种，在小细胞肺癌（Small cell lung cancer，SCLC）患者血清中明显增高，NSE已经成为目前临床检测SCLC最敏感和特异的肿瘤标志物。SCLC对复合化疗及放疗比较敏感，绝大多数患者经化疗或合并放疗后，肿瘤缩小，NSE明显降低，与治疗前相比具有显著性差异。但大多数SCLC病人仍会复发，NSE活性水平变化，可以用来监测SCLC患者的病情发展，评价治疗效果，预报复发，一般在4～12周即可预知SCLC的复况，其方法要比X线胸透检查更加简单和方便。因此测定血清中NSE水平对SCLC的诊断、鉴别、病情判断及疗效的评估具有重要的临床意义。

本工作拟通过改变NSE免疫放射分析药盒中固相抗体包被时间，干燥方法，标记物标记条件以及反应时间等实验，从而提高最大结合率和I125标记率，并缩短反应时间，以提高药盒质量。

1 仪器与材料

1.1 主要仪器

伽玛计数器：美国DPC公司产品GAMMA-C12；电热恒温培养箱：上海一恒科技有限公司产品DHP-9272型；冻干机：上海东富龙股份有限公司产品LY-3；加样器：瑞士SCOREX公司产品。

1.2 主要试剂

NSE单克隆抗体：芬兰Medix公司产品；NaI125 ：美国PE公司产品；NSE免疫放射分析药盒：原子高科股份有限公司产品；实验所用其他化学试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 包被条件的改进

2.1.1 包被时间的改进

在不改变标记率和包被管抗体浓度的情况下，将原来的室温过夜包被改为4°C包被两天，随后通过分析曲线对两种不同包被方法的包被管进行比较。

2.1.2 包被管干燥储存方法的改进

本药盒包被管原采用室温自然干燥法，此方法干燥时间较长，且干燥效果易受天气条件影响。为提高包被管稳定性，缩短干燥时间，遂采取冻干法对包被管进行处理。具体方法为将包被管置于冻干机中，然后进行抽真空处理，压强达到15Pa后对板层进行加热，加热到30℃后维持2个小时，随后取出包被管，置于铝箔袋中抽真空密封保存。

2.2 I125标记条件的改进

在标记过程中，原标记条件为氧化剂（ch-T）投入量7ug，氧化反应时间为2分钟，此条件下标记率偏低。通过改变氧化剂投入量和反应时间，选择比活度较高的反应条件进行标记，并通过分析曲线进行实验结果的比较。

2.3 反应时间的改进

原分析程序中，加入125I标记NSE单克隆抗体后要在2～8°C过夜，反应时间过长。实验设定37°C条件下，反应时间分别设置为1、2、3、4个小时，观察不同反应时间对免疫分析标准曲线的影响。

3 实验结果

3.1 包被条件的改进

3.1.1 包被时间的改进

在不改变标记率和包被管抗体浓度的情况下，将原有的室温过夜包被改为4°C包被两天，不同包被条件的实验结果列于表1。结果显示，4°C包被两天可以提高药盒信噪比，最大结合率及线性系数。

3.1.2 包被管干燥方法的改进

分别对采用不同方法进行干燥的包被管进行实验，实验结果如图1所示，采用冻干方法进行干燥的包被管的分析信噪比和最大结合率均优于自然干燥法。

3.2 I125标记反应条件的改进

为提高标记率，本实验对标记过程中的一些实验条件进行了修改：（1）加大氧化剂量，把氧化剂加入量7ug改为10ug。（2）调整氧化反应时间，每隔一分钟测量一次比活度，结果列于表2。

采用了较高比活度23.8μci/ug，反应时间为4分钟的标记产品进行稀释，然后进行免疫分析实验，实验结果显示曲线最大结合率可提高到29.2%。

3.3 反应时间的改进

标准曲线结果如图2，可以得知，37°C温育4个小时与2～8°C过夜的标准曲线相近。所以选择37°C温育4个小时进行免疫分析实验。

3.4 改进条件后的分析曲线及稳定性实验

将改进后的固相抗体包被管密封后，放入37℃条件下分别放置4天、1周、2周，然后进行免疫分析，并同新包被的包被管进行了标准曲线比较，结果如表3所示。可以看出标准曲线最大结合率和相关系数基本相当，四条标准曲线基本吻合，表明改进后的固相抗体包被管在37℃条件下存放两周具有良好的稳定性。

4 结论

在药盒的生产以及发货过程中，由于包被时间过短，使药盒标准曲线易出现灵敏度和最大结合率下降，天气潮湿导致包被管不易自然干燥，天气转冷时导致标记率下降和反应时间过长等一系列问题。我们为此做了大量的实验工作，通过对固相包被时间和标记过程中反应条件的优化以及反应时间的改善，从而提高结合率和标记率，缩短了免疫反应时间，进而提高了药盒质量和工作效率。

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