南京市外环境水体及水产品致病性弧菌污染状况分析

【摘要】目的：了解南京市外环境水体与水产品中致病性弧菌污染状况，预防和控制此类食物中毒的发生。方法：采集外环境水体与水产品，用碱性蛋白胨水增菌、庆大琼脂、TCBS琼脂、科玛嘉弧菌显色琼脂分离，对分离出的致病性弧菌进行系统生化鉴定，对分离出的霍乱弧菌用血清学和多重荧光PCR方法进行分型与毒力检测。结果：2011年共采集南京市外环境水体与水产品共151份，其中检出致病性弧菌8种，共38株，检出率依次为霍乱弧菌7.28%、副溶血弧菌5.83%、嗜水气单胞菌4.64%、溶澡弧菌3.33%、温和气单胞菌3.31%、创伤弧菌1.67%、梅氏弧菌0.83%、类志贺邻单胞菌0.83%。其中分离出的霍乱弧菌均为非01/非0139群霍乱弧菌且不携带霍乱肠毒素。结论：2011年水产品中非01/非0139群霍乱弧菌污染较为严重，其次为副溶血弧菌、创伤弧菌等；外环境水体中嗜水气单胞菌污染较为严重，需加强外环境水体与水产品的监测，做好预防控制疾病工作。

【关键词】 致病性弧菌； 外环境水体； 水产品； 霍乱肠毒素

致病性弧菌广泛分布于海水、淡水、海产品中，人类摄入或接触污染的水源和食物易引起感染。近年来，有关致病性弧菌引起卫生健康事件时有报道[1-3]。为了解南京市外环境水体及水产品中致病性弧菌的污染状况，采用传统培养法进行分离培养鉴定，并进行毒力检测，为及时发现、及时预测疫情和制定防治策略提供依据。现将南京市疾控中心2011年对151份外环境水体及水产品监测情况报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本采集与种类

1.1.1 外环境水体 取自南京市中山陵燕雀湖，每个取样点分成相隔数米的位置，分别用灭菌采样瓶采集，共31份。

1.1.2 水产品 取自南京市下关区惠明桥水产品批发市场，共120份。

1.2 试剂与仪器 法国梅里埃ATB生化鉴定仪、ABI 7500 Fast型实时荧光定量PCR仪。弧菌科玛嘉显色培养基及ID32E生化试剂条均购自法国梅里埃公司。碱性蛋白胨水、TCBS选择性琼脂、庆大选择性琼脂由环凯公司生产。霍乱弧菌DNA多重荧光PCR试剂盒购自厦门百维信生物科技有限公司。霍乱弧菌诊断血清购自宁波天润生物药业有限公司。均为有效期内使用。

1.3 检测方法 霍乱弧菌依据《霍乱防治手册》，其他弧菌依据《全国临床检验操作规程》进行检测。样本接种碱性蛋白胨水培养37 ℃ 8 h，取菌膜下表层培养物再次接种碱性蛋白胨水二次增菌培养37 ℃ 8 h，取二次增菌液培养物转种庆大选择性琼脂、TCBS选择性琼脂、弧菌科玛嘉显色琼脂培养37 ℃ 24 h，挑取可疑菌落转种双糖铁琼脂、营养琼脂，纯化的菌种进行生化及血清学检测，生化结果符合霍乱弧菌的菌株用四重荧光PCR方法进行分型与霍乱肠毒素检测。

2 结果

2.1 外环境水体、水产品致病菌检测情况 2011年采集南京市外环境水体、水产品样本共151份，检出致病性弧菌8种，共38株。外环境水体中检出3种致病性弧菌，分别为嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和非01/非0139群霍乱弧菌，其中嗜水气单胞菌检出率最高，达16.2%；水产品中非01/非0139群霍乱弧菌检出率最高，达8.33%，其次为副溶血弧菌、溶藻弧菌等7种其他致病性弧菌。见表1。

2.2 血清学方法检测霍乱弧菌 对分离出的11株霍乱弧菌经血清凝集试验均为自凝菌，无法分型。

2.3 多重荧光PCR方法对霍乱弧菌分型和毒力检测 对分离出的11株霍乱弧菌进行四重荧光PCR检测，分别针对霍乱弧菌hlyA基因、霍乱01菌群特异性基因01rfb、霍乱0139菌群特异性基因0139rfb和霍乱产毒基因ctxA，结果均为霍乱弧菌hlyA基因阳性、其他三种基因阴性，故均判定为非01/非0139群霍乱弧菌，不携带霍乱肠毒素。

3 讨论

2011年对31份外环境水体检测结果显示，嗜水气单胞菌为主要污染菌，检出率达16.2%，其次为温和气单胞菌检出率为6.45%。人类感染气单胞菌主要以肠道感染为主，所感染的气单胞菌以嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和豚鼠气单胞菌为主[4]。气单胞菌可产生肠毒素、溶血素、细胞毒素等，均有较强的致病性，免疫功能低下或合并慢性疾病患者易感染，且可发生肠道外感染，如心内膜炎、咽炎、肺炎、胆囊炎等，甚至出现败血症、感染性休克和肺水肿等严重并发症[5]。目前，国外已将嗜水气单胞菌纳入腹泻病原菌的检测范围，是食品卫生检测的对象，下一步本实验室还将对 所分离的菌株做进一步毒力基因测定和耐药性试验。

2011年对120份水产品检测，非01/非0139群霍乱弧菌检出率为8.33%，在所有检出的致病性弧菌中排列首位。近年来国内外关于非01群霍乱弧菌致病的报告逐渐增多，在国内非01/非0139群霍乱弧菌是引起夏、秋季腹泻和食源性疾病的主要病原菌，据报道其发病率有超过沙门菌、志贺菌[6]。霍乱弧菌致病关键因素是霍乱肠毒素（CT）和毒素共调菌毛（TCP）。霍乱毒素基因ctxAB并非为霍乱弧菌所固有，而是由霍乱弧菌染色体上的一种溶原性噬菌体基因组所携带，该单元可被诱导为形成新的子代噬菌体，整合入受体菌染色体上特异位点，会导致毒素基因在产毒株和非产毒的非致病性菌株间的水平转移。CT是由ctxAB基因编码；TCP作为定植因子，由tcp基因编码。研究表明，霍乱弧菌存在ctxA+tcpA+、ctxA-tcpA+、ctxA-tcpA-的致病相关基因模式，提示tcp是获得CTX因子的前提，tcp的表达对于CTX因子在有毒株和无毒株问的转移至关重要[7]。提示缺少CT的菌株可能通过与产毒性01、0139霍乱弧菌不同的机制引起人体腹泻。当菌株缺失部分或全部CTX毒力因子上的基因时，可能产生其他毒素，如NAG-特异性热稳定毒素、热稳定直接溶血素、志贺样毒素等，它们在致腹泻的机制中可能起到某种促进的作用。此次分离出的非01/非0139群霍乱弧菌经检测均不携带霍乱肠毒素，但未检测tcp及其他毒素，不排除有获得霍乱肠毒素及携带其他毒素的可能，需进一步检测，并引起有关部门的高度重视，及时制订有效的、针对性强的预防控制措施。

本次检测从水产品中还检出副溶血弧菌、创伤弧菌等其他致病性弧菌。其中副溶血弧菌7株，分离自花螺、龙虾和扇贝，分离率仅次于非01/非0139群霍乱弧菌。副溶血弧菌是引起食源性疾病的重要病原之一，可导致患者腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应。创伤弧菌检出2株，分离自海螺和章鱼。创伤弧菌能够引起胃肠炎、伤口感染和原发性败血症，通常人类感染是因为食用生或半生的受污染海产品。创伤弧菌是美国海产品消费引起死亡的首要原因，美国州际贝类卫生委员会（ISSC）规定，收获后经处理的牡蛎中创伤弧菌限量不超过30 CFU/g[8]。由于人们饮食习惯的改变，对于海产品等的食用量增加，生吃水产品的品种越来越多，人群暴露的机会和规模都呈上升的趋势，造成食物中毒的潜在危险，致泻性弧菌成为感染性腹泻的主要致病菌。同时，食品加工存在生熟不分、加热不透现象，饮食卫生环节存在薄弱环节，因此，必须进一步加强对外环境，尤其是水产品的监测，掌握病原菌分布特点，研究其与人群发病的关系，以便及时采取措施降低危害。依据此次监测结果显示，生食水产品极易引起食物中毒，因此，相关部门要积极采取措施，加强宣传，教育市民食用水产品一定要煮熟、煮透，尽量避免生食、半生食，又做到刀板、食具、容器生熟分开，操作过程中防止交叉污染，并防止由此引起的食物中毒。

参考文献

[1] 邱波，王本利.一起食物中毒分离出溶藻弧菌的病原学研究[J].职业与健康，2004，20（11）：65-66.

[2] 秦树民，冯艳洁.一起副溶血性弧菌食物中毒引起的类霍乱样腹泻[J].中国卫生检验，2008，18（6）：1202.

[3] 白丽娜，张敬党.一起由嗜水气单胞菌引起食物中毒的病原学调查[J].现代预防医学，2008，35（7）：1360-1362.

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[5] 蒲增惠，于红霞.成人急性感染性腹泻中气单胞菌的分离与临床 分析[J].中华传染病杂志，2010，28（6）：379-380.

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[7] 王鸣，李孝权.2001至2005年广州地区霍乱弧菌相关基因体征分析[J].中华预防医学杂志，2006，40（4）：257-261.

[8] Panicker G，Bej A K.Real-time PCR detection of vibrio vulnificus in oysters：comparison of oligonucleotide primers and probes targeting vvhA[J].Appl Environ Mierobiol，2005，71（10）：5702-5709.

（收稿日期：2012-09-03） （本文编辑：连胜利）