EV71免疫学研究进展

【中图分类号】R19 【文献标识码】B 【文章编号】1004-7484（2013）04-0081-02

肠道病毒71型（enterovirus71，EV71）属于小RNA病毒科肠道病毒属的单正链无包膜RNA病毒。1974年Schmidt等人首次从美国加利福尼亚州患有中枢神经系统症状疾病的婴儿患者中分离到EV71病毒，随后世界上许多国家相继报道了EV71在不同地区的流行情况，EV71一共引起了10多次的世界范围的爆发和流行，其中又有四次大的流行[2]。我国从2008年阜阳爆发EV71以来，共报告手足口病例192344例，发病率为 37.01/10万，其中重症病例2119，死亡病例94，在我国主要流行株已经从90年代初的B亚型和C2亚型转变为C4亚型。 在丙类传染病中发病数位于第三，而死亡数为第一位。EV71可经消化道、呼吸道传播，易造成流行。EV7l传染性强，传播途径复杂，短时间内可造成大规模流行。人对EV71普遍易感，成人多已通过隐性感染获得免疫力，因此感染后发病患者主要为学龄前儿童。EV71感染引起的临床表现多样，主要表现为手足口病（hand footmouth disease，HFMD），部分患儿表现为疱疹性咽峡炎，少部分重症患者出现脑炎、脑脊髓膜炎、肺水肿、肺出血等。

目前尚无有效疫苗能预防感染，临床主要以对症治疗为主，缺乏特异、高效的抗病毒药物，尤其是EV71感染所致重症病例病情进展快，预后差，病死率高，对于EV71的基础研究目前也只停留在比较基础的水平。研究EV71作为一种病原所引发的机体免疫应答，对了解病毒的致病机制、制定预防诊治策略具有重要意义。

一、病毒结构

EV71的病毒颗粒呈二十面体立体对称近似球形的结构，直径24～30 nm，无包膜。核衣壳由60个亚单位构成，每个亚单位由四种衣壳蛋白（VPl、VP2、VP3、VP4）组成的五聚体构成。病毒基因组为7408个核苷酸，仅有一个开放阅读框（ORF），编码含2193个氨基酸的多聚蛋白（Polyrotein），多聚蛋白进一步水解为 VP1，VP2，VP3和VP4，这四个外壳蛋白先形成原聚体，再由5个原聚体结合形成病毒颗粒。在其两侧分别为5’～非编码区和3’一非编码区。3’一非编码区的末端含有一个长度可变的多聚腺苷酸尾巴（poly-A），而其5’末端共价结合有一个小分子量的蛋白（VPg）。在这四种结构蛋白中，VP4位于衣壳内部，与病毒核心连接，VPl、VP2和VP3均暴露在病毒衣壳表面，带有抗原表位。VPl还与病毒与靶细胞的结合有关。

二、病毒受体的研究

肠道病毒在人体内具有广泛的受体，病毒感染人体后可与不同靶组织的受体相结合，从而出现复杂的临床表现。病毒与宿主细胞受体的特异性结合决定了病毒感染的组织趋向性，不同种类和型别的肠道病毒，其特异性受体不完全相同。肠道病毒的特异性受体至少包括细胞间黏附分子 -1（intracellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、晚期活化抗原-2（very late activation antigen，VLA-2）、补体衰变加速因子（decay accelerating factor，DAF）等。VP1蛋白在病毒表面形成的峡谷样结构是受体的结合位点。感染细胞时，病毒首先与细胞表面的特异性受体结合，完成吸附过程，然后病毒空间构型发生改变，丢失VP4并最终脱去衣壳，病毒RNA进入胞浆。病毒RNA为感染性核酸，进入细胞后可直接起mRNA作用，转译出多聚蛋白，多聚蛋白经酶切后形成病毒结构蛋白和功能蛋白。细胞被感染后约30分钟，细胞蛋白合成迅速下降至零，称为“关闭”（shut-off），主要由肠道病毒蛋白酶裂解细胞真核翻译起始因子-4G（eukaryote initiation factor 4G，eIF-4G）造成。细胞蛋白翻译“关闭”是肠道病毒细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）的主要机制。Betsy Yang[7]等在2009年曾报道在DLD-1人结肠腺癌细胞表面的吐液酸化的葡聚糖是EV71病毒的后来，后来日本的两位科学家Seiya Yamayoshi和Yorihiro Nishimura等经过一系列实验分别证明了清道夫受体B2和P选择素糖蛋白配体1均是EV71病毒在人细胞上的受体分子。

三、体液免疫应答

特异性体液免疫产生的中和性抗体在病毒感染的预防以及疾病后期降低病毒载量方面都有很明显的意义，对EV71引起的体液免疫的研究由来已久，其他体液免疫的研究主要为疾病诊断提供了辅助手段。Foo等在EV71的VPl上发现一个线性表位SP32，蛋白印记实验显示重组表达的谷胱甘肽转硫酶（GST）一SP32融合蛋白能与人EV71 IgG抗体特异性结合，而与柯萨奇病毒CA9和埃可病毒（Echo 6）无反应。Wang等[13]设计一种检测抗EV71 IgM的ELISA实验，用于EV71感染的早期诊断。用该方法检测236例患者的336份标本，以病毒分离和中和实验为标准，该ELISA法的敏感性和特异性分别达到97.7%和93.3%，发病7 d以内IgM即可呈阳性，并可持续到发病后94 d。这一方法有望为I临床早期诊断EV71感染提供辅助手段。Jian-Feng Han等报道非中和性抗体能在体内外实验中可以加重EV71感染后的症状，在THP-1细胞和乳鼠模型中均能增加细胞的病变和动物的感染症状。Shih-Min Wang]等发现，在针对EV71非中和性抗体存在的条件下，病毒对THP-1细胞的质细胞病变作用更加强烈。而这一增强作用可以被抗-Fcγ抗体减弱，这个Fcγ主要存在于6-11个月的婴儿体内，这就解释了为什么婴幼儿感染感染EV71病毒以后的症状要比成人严重。

四、细胞免疫应答

机体对病毒抗原的细胞免疫应答主要依赖于两种细胞，即由主要组织相容性复合体（MHC）Ⅱ限制的CD4+T细胞和受MHCⅠ分子限制的CD8+T细胞。CD4+T细胞主要分泌细胞因子如白细胞介素IL-2、IL-3、IFN-γ和TNF-β等来调节体内的免疫应答，CD4+的Th细胞与CD8+T细胞接触以辅助CD8+T细胞分化成CTL细胞用以特异性杀伤靶细胞，产生细胞毒作用。既往有对不同肠道病毒结构蛋白保守序列的免疫原性进行研究。Cello]等合成15个存在于六种不同肠道病毒结构蛋白上的保守区域肽段，有9个肽段能刺激健康献血员的外周血单个核细胞产生的IFN-γ，而且其中4个肽段能诱导T细胞增殖。这一研究表明，在脊髓灰质炎病毒1，柯萨奇病毒B3、B5、B6、A9和埃可病毒间存在保守的T细胞表位，这些表位多位于VP2和VP3核壳蛋白上，VP1上较少，而VP4上未发现交叉反应性的T细胞表位。提示包括EV71在内的肠道病毒结构蛋白保守序列可能存在的表位，值得深入研究。Chang]等对EV71感染后不同疾病转归患者的细胞和体液免疫应答的研究发现，同时出现脑干脑炎及肺水肿患者的细胞免疫应答显著低于仅有中枢神经系统受累患者和轻症患者，具体表现在肺水肿患者的PBMC经EV71抗原刺激后，IFN-γ、IL-1β、IL-6、TNF-a、巨噬细胞炎症蛋白-lα（M1P-lα）等的产生明显低于其他患者，而不同患者组间中和抗体效价差异无统计学意义。推测EV71感染后肺水肿的出现可能与特异性细胞免疫应答强度较弱有关。Yang等探讨EV71感染后出现脑膜脑炎与未出现脑膜脑炎患儿免疫应答的差异，发现CD4+细胞表面CD40配体的表达在脑膜脑炎组显著下降，检测该组患儿细胞毒性T淋巴细胞抗原-4基因多态性，显示其外显子1的49位上G/G基因型频率显著高于无脑膜脑炎组，而中和抗体效价无论在急性期还是康复期，两组间差异均无统计学意义。提示细胞免疫的异常可能与EV71感染的中枢神经系统受累有关。

总之，EV71感染后机体能产生保护性免疫应答，其中中和抗体在清除病毒、预防感染中发挥重要作用，非中和性抗体的存在可以加速疾病的症状。而细胞免疫应答可能与感染后病情轻重及不同临床转归有 关。

参考文献：

[1] IN Qi（金奇）.Medical Molecular Virology（医学分子病毒学）[M].Beijing（北京）：Science Press（科学出版社），2001：606.

[2] Peter C. McMinn. An overview of the evolution of enterovirus 71 and its clinical and public health significance. FEMS Microbiology Reviews 26 （2002） 91-107.

[3] 卫生部. 手足口病预防控制指南2009年版.

[4] Pallansch，M. & Roos，R. Fields Virology Ch. 25，839893 （Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，2006）.

[5] Seiya yamayoshi. Yasuko yamashita. et al. scavenger receptor b2 is a cellular receptor for enterovirus 71. volume 15 [ number 7 [ july 2009 nature medicine.

[6] Foo DG，Alonso s。Phoon MC，et a1.Identification of neutralizing 1inear epitopes from the VPl capsid protein of Enterovirus 71 using synthetic peptides.Virus Res，2007.1 25：61-68.

[7] Foo D G，Alonso S，Chow V T，et a1. Passive protection against lethal enterovirus 71 infection in newborn mice by neutralizing antibodies elicited by a synthetic peptide.Microbes Infect，2007，9： 1299-1306.

[8] Wang SY.Lin TI，，Chen HY，et a1.Early and rapid detection of enterovirus 7 1 infection by an IgM-capture ELISA.J Virol Methods.2004，119：37―43.

[9] Jian-Feng Han.et al.Antibody dependent enhancement infection of Enterovirus 71 in vitro and in vivo. Virol J. 2011；8： 106.

[10] Shih-Min Wang. et al. Enterovirus 71 Infection of Monocytes with Antibody-Dependent EnhancementClin Vaccine Immunol. 2010 October；17（10）： 15171523.