红景天苷体外抗EV71病毒的作用

摘要：应用MTT法研究红景天苷对Vero细胞的毒性以及对肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）的抑制作用，通过吸附试验和穿入试验观察红景天苷是否对EV71的吸附和穿入具有抑制作用。结果表明，红景天苷的细胞毒性低，半数细胞毒性浓度（CC50）为4.25 mg/mL。药物在病毒感染前加入（药物预处理）、药物和病毒同时加入及药物在病毒感染后加入都能够抑制病毒，以药物预处理细胞抗病毒作用最好；红景天苷能够抑制病毒的吸附和穿入作用，对吸附作用抑制效果更强。表明红景天苷能够在体外抑制病毒对细胞的感染。

关键词：红景天苷；肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）；Vero细胞；体外抑制

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）15-3605-04

肠道病毒71型（Enterovirus 71，EV71）是单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属[1，2]。该病毒可感染T淋巴细胞、人血管内皮细胞和神经细胞，触发受感染细胞凋亡[3-5]，引起人类手足口病（Hand，foot and mouth disease，HFMD），进而引发脑炎（Encephalitis）、无菌性脑膜炎（Aseptic meningitis）和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病（Poliomyelitis-like paralysis）等多种神经系统相关并发病，致残和致死率较高[6-8]，自1974年以来，已在全球多次暴发和流行[9]，目前尚无特效疫苗和药物。

有研究表明，许多中药及其活性成分能够有效抑制EV71病毒[10-12]，所以，从传统中药中筛选抗EV71病毒药物越来越得到重视。红景天苷是从红景天（Rhodiola rosea L）中提取的植物天然活性成分，具有抗衰老、抗癌、抗炎症、肝癌保护和抗氧化作用等多种药学特性[13-15]，对心肌细胞的缺氧/复氧损伤具有保护作用[16]，具有改善心脏功能和保护心肌细胞作用[17]。已有研究表明红景天苷对柯萨奇病毒具有显著的抑制作用[18]，在此基础上，本研究对红景天苷在体外培养的细胞水平上抗EV71的作用进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 试验材料和仪器

参试药物红景天苷（粉末状，HPLC测定纯度>98%）购自苏州宝泽堂医药公司；动物非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）株购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所；EV71由河北省邯郸市疾病预防控制中心惠赠；达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）、胎牛血清、胰酶、青霉素和链霉素均购自GIBCO；二甲基亚砜（DMSO）和溴化二甲噻唑二苯四氮唑（MTT）购自Sigma公司。CO2培养箱为Thermo产品；酶标仪（ELX808IU）为BioTek产品；倒置荧光显微镜（TS100）为Nikon产品。

1.2 试验方法

1.2.1 Vero 细胞培养 取DMEM培养基[添加1%双抗（青霉素100 U/L，链霉素100 U/L）、10%胎牛血清，作为细胞生长液]4 mL于25 cm2培养瓶中，取冻存的Vero细胞株复苏，于5% CO2培养箱中37 ℃培养。

1.2.2 红景天苷对Vero细胞的毒性试验 参照Nociari等[19]的方法，取上述Vero细胞（1×105个/mL）接种于96孔板， 培养24 h，用细胞维持液（成分与细胞生长液相同，但含2%胎牛血清）稀释红景天苷使其终浓度分别为1、2、3、4、5、6、7、8 mg/mL，吸去原培养液，将各浓度红景天苷分别加入各孔，以未加药物组作为阴性对照，以无细胞的DMEM作为空白对照。每个浓度3复孔。在5% CO2培养箱37 ℃孵育48 h，吸尽培养液， 每孔加入5 mg/mL的MTT 溶液10 μL，37 ℃下继续孵育4 h，小心去除培养液，加入DMSO 150 μL， 轻轻振荡以溶解结晶，用酶标仪测定A490 nm值，细胞存活率= （试验组A490 nm-空白对照组A490 nm）/（阴性对照组A490 nm-空白对照组A490 nm）×100%。以细胞存活率为50%的药物浓度作为半数细胞毒性剂量（CC50）。

1.2.3 红景天苷对EV71的抑制作用 用“1.2.2”方法在96孔培养板中接种和培养单层细胞24 h，按照100 TCID50的量加入EV71，同时加入不同浓度（0.062 5、0.125 0、0.250 0、0.500 0、1.000 0 mg/mL，下同）红景天苷，培养48 h。各孔加液量、培养条件、A490 nm测定方法（MTT法）和细胞存活率计算方法同“1.2.2”。

1.2.4 红景天苷不同处理方式对EV71的抑制作用 用“1.2.2”方法在96孔培养板中接种和培养单层细胞24 h。分为A、B、C 3组，按照3种不同方式分别加药。A组：病毒感染后加药。按照100 TCID50的量加入EV71病毒，吸附2 h，吸去病毒液，加入不同浓度红景天苷，培养48 h；B组：同时加药物和病毒。不同浓度红景天苷与100 TCID50 EV71混合，于37 ℃作用2 h，随后加入96孔板培养48 h；C组：药物预处理。用不同浓度红景天苷分别预处理细胞2 h后，加入100 TCID50 EV71培养48 h。每个浓度3复孔。同时设有病毒对照和细胞对照。细胞存活率=（试验组A490 nm-病毒对照组A490 nm）/（细胞对照组A490 nm-病毒对照组A490 nm）×100%。

1.2.5 红景天苷对EV71吸附的抑制试验 用“1.2.2”方法在96孔培养板中接种和培养至其铺满单层细胞后，将96孔板置于4 ℃无菌条件下预冷1 h，按照100 TCID50的量加入EV71病毒，随即加入不同浓度的红景天苷，4 ℃下静置孵育3 h，弃去全部培养液，用PBS冲洗3次以去除尚未吸附的病毒，加入细胞生长培养基在孵箱中培养48 h后用MTT法测定其A490 nm。每个浓度3复孔。同时设有病毒对照和细胞对照。细胞存活率的计算参照“1.2.4”。

1.2.6 红景天苷对EV71穿入的抑制试验 参照“1.2.5”中的方法将铺满单层细胞的96孔板在4 ℃无菌条件下预冷1 h并加入EV71，继续静置3 h，随即加入不同浓度的红景天苷，置于37 ℃培养，使病毒最大限度穿入细胞。以每10 min为间隔，以pH 11的无菌PBS液冲洗细胞以终止病毒穿入，随后立即加入pH 3的无菌PBS液冲洗细胞，之后加入细胞生长培养基，继续培养48 h后用MTT法测定A490 nm。每个浓度3复孔。同时设有病毒对照和细胞对照。细胞存活率的计算参照“1.2.4”。

1.2.7 数据处理 所有数据均采用“平均数±标准差”表示。使用Microsoft Excel和SPSS 18.0进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 红景天苷细胞毒性

由图1可见，红景天苷参试最低浓度（1 mg/mL）时，细胞存活率接近100%；浓度提高时，细胞会出现死亡；参试最高浓度（8 mg/mL）时细胞存活率仍接近50%，其CC50为4.25 mg/mL，约是常用广谱抗病毒药物利巴韦林（即病毒唑，CC50为244.76 μg/mL[20]）毒性的1/17。

2.2 红景天苷对EV71的抑制作用

将不同浓度的红景天苷与100 TCID50的EV71加入至细胞中培养48 h后，倒置显微镜下观察可见，试验组与病毒对照组相比，96孔板中出现细胞病变效应（CPE）的程度明显降低。MTT法测孔的A490 nm值并计算细胞存活率，结果见图2。由图2可见，红景天苷可抑制EV71的感染作用，且具有浓度依赖性，但红景天苷浓度达0.500 0 mg/mL后对病毒的抑制效果较稳定。

2.3 红景天苷不同处理方式对EV71的抑制作用

由表1可见，红景天苷不同方式处理EV71病毒并培养48 h后，均可提高细胞存活率，对病毒产生一定的抑制作用，其中以C组（药物预处理组）效果最为明显。由图3可见，未加入红景天苷的一组出现强烈的细胞病变效应（CPE）（图3B），而用0.500 0 mg/mL红景天苷对EV71进行不同处理后都能够抑制CPE反应，与表1结果一致。

2.4 红景天苷对EV71吸附和穿入的抑制作用

由表2可见，红景天苷可抑制EV71的吸附和穿入作用，且抑制吸附作用效果好于抑制穿入作用。红景天苷对EV71吸附和穿入的抑制作用在其浓度小于0.500 0 mg/mL 时随浓度的增加其抑制作用不断增强，在大于这一浓度后反而有所下降。

3 小结与讨论

本试验结果表明，在体外培养细胞的水平上，红景天苷的半数细胞毒性剂量约是常用的广谱抗病毒药物病毒唑的1/17，说明红景天苷的毒性很低，其安全性很高，因此选择合适的浓度不会对细胞造成损害，同时说明其抗病毒作用并不依赖于其毒性。结合红景天苷抑制病毒CPE的试验结果来看，红景天苷在体外培养细胞水平上具有抑制EV71的致细胞病变作用，对病毒的抑制作用随着药物浓度的提高而提高。但通过比较红景天苷不同处理方式对EV71的抑制作用，发现红景天苷预处理细胞后具有较好的抗病毒效果，而在病毒吸附细胞后加入红景天苷或红景天苷直接与病毒液混合虽然也有一定的抗病毒作用，但其抑制作用不强，不能有效抑制病毒在细胞内的增殖。

尽管EV71的整个复制周期尚未完全研究清楚，但其关键步骤主要包括病毒吸附、脱衣壳、衣壳蛋白合成、病毒RNA复制和病毒组装。这些关键的步骤都可成为抗病毒药物研究的作用靶点。现有的有效治疗EV71药物正积极地靶向这些过程[21]。本研究中对EV71吸附和穿入的抑制试验结果显示红景天苷抑制病毒吸附作用更强。有研究表明益生菌通过竞争抑制结合到细胞表面的病毒受体上，可抑制病毒感染宿主细胞。Freitas等[22，23]发现益生菌Lactobacillus casei DN1 14001和多形拟杆菌产生一种可溶性化合物，可调节细胞表面糖基化，保护上皮细胞免受轮状病毒感染。推测红景天苷可干扰病毒与细胞表面受体结合，从而达到其抑制病毒感染的作用。

本试验初步明确了红景天苷抗肠道病毒EV71的作用，红景天苷可直接干扰病毒的吸附作用，机制可能是其与细胞表面受体结合产生竞争抑制从而抑制病毒感染，需要进一步试验验证。高淑华等[24]研究还发现红景天苷和苦参及黄芪等中药联合使用具有良好抗EV71效果，因而推测红景天苷与其他药物联用可能具有更好的抗病毒效果。这将是下一步研究的方向。

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