EV71感染手足口病患儿细胞及体液免疫功能研究

[摘要] 目的 探讨EV71感染手足口病患儿细胞免疫及体液免疫功能变化。 方法 将92例EV71感染的手足口病患儿分为重型组、轻型组，另选正常健康对照组儿童30例为对照组，检测各组静脉血T细胞亚群、B细胞表达情况，免疫球蛋白及补体C3、C4水平及TNF-α、IL-6及IL-10水平。 结果 重型组及轻型组患儿Th及Ts细胞比例降低，B细胞比例升高，TNF-α、IL-6、IL-10水平升高，IgA、IgG、C3、C4水平升高，各组间差异有统计学意义。 结论 EV71感染手足口病患儿存在细胞及体液免疫异常情况，并且同病情相关，临床检测有助于病情预测及预后评估。

[关键词] 肠道病毒71；手足口病；细胞免疫；体液免疫；免疫球蛋白

[中图分类号] R725.1 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）09-0028-03

手足口病是由肠道病毒感染引起的常见的小儿传染病，多由肠道萨科奇A型病毒及EV71病毒感染引起，具有较高的传染性，是我国重点监控的小儿传染病之一。患儿感染后病毒繁殖引起病毒血症，并且对组织及器官具有侵袭性，引发患儿的多器官功能损伤，甚至引起功能衰竭，在手、足口等黏膜部位及组织受压部位，病毒容易聚集、繁殖引起局部组织病变，表现为典型的临床症状，手、足及皮肤黏膜损害。近年来的研究结果显示[1，2]，在大部分病毒感染疾病中，体液免疫及细胞免疫均参与疾病的进展及组织损伤过程，本研究就EV71感染致病的手足口病患儿体内细胞免疫及体液免疫功能的变化进行研究，为EV71感染手足口病患儿的临床治疗及预后评估提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择我院儿科2010年2月～2012年3月诊断并治疗的EV71病毒感染致病的手足口病患儿92例，患儿年龄0.6～7.8岁，平均（3.2±1.6）岁，其中男52例，女40例，患儿均经PCR核酸检测明确诊断，病程1～5 d，平均（3.2±1.1）d，并排除使用免疫抑制剂治疗、患有结核、其他病毒感染性疾病及免疫疾病患儿，患儿入选后按《手足口病诊疗指南（2010）》标准分为轻型组及重型组[3]，其中轻型组38例，男22例，女16例，年龄0.6～7.6岁，平均（3.1±1.7）岁，病程2～5 d，平均（3.5±1.3）d，重型组54例，其中男30例，女24例，年龄0.6～7.8岁，平均（3.2±1.5）岁，病程1～5 d，平均（3.0±1.2）d，对照组儿童30例，其中男18例，女12例，年龄1～9岁，平均（3.7±1.8）岁，三组间性别比例、年龄等一般资料差异无统计学意义（P > 0.05）。

1.2 试剂及仪器

1.3 标本检测

1.3.1 血清炎性介质检测 各组血清炎性介质TNF-α、IL-6及IL-10检测采用比色法，患儿抽取清晨空腹静脉血，低温离心血清，超低温冰箱保存，分批检测，检测试剂标准品梯度稀释，蒸馏水空白对照，721型分光光度计检测各管吸光度，绘制标准曲线，横坐标为吸光度，纵坐标为样品浓度，血清标本解融后梯度稀释至检测范围，采用微量加样器，48孔板每孔加入100 μL标本，以蒸馏水作为空白对照，各组标本加入检测试剂盒抗体，室温孵育30 min，依次加入X Biotin和X HRP，充分混匀，加入TMB室温孵育15 min显色，采用稀硫酸终止反应，分光光度计测量各孔吸光度，绘制检测曲线，依据标准曲线计算各检测样品检测物浓度。

1.3.2 IgA、IgG、IgM及C3、C4检测 IgA、IgG、IgM及C3、C4检测采用放射免疫法，清晨采集空腹静脉血，低温离心得血清，深低温冰箱保存，标准品梯度浓度稀释，依次计入一抗及I131标记的二抗后室温孵育，采用放射免疫 γ 计数仪检测放射浓度，绘制标准曲线，标本解融后按照上述步骤进行标记检测，绘制检测物曲线，依据标准曲线计算检测标本浓度。

1.3.3 T细胞及B细胞检测 患儿清晨抽取空腹静脉血，加入流式细胞仪专用红细胞裂解液2 mL，室温震荡，加入淋巴细胞分离液，室温震荡20 min，低速离心淋巴细胞，弃去上清液，淋巴细胞加入PH值为7.0的PBS缓冲液充分洗涤，上机检测，每个检测管获取1000个细胞，采用CD3+抗体标记T细胞，采用CD4+抗体标记Th细胞及Ts细胞，采用CD19+抗体标记B淋巴细胞，检测完毕后采用Cellquestpro软件进行分析。

1.4 统计学方法

3 讨论

手足口病是病毒感染引起的常见儿童传染病，手足口病多发病隐匿，传染性强，多种肠道病毒感染均可引起手足口病，除典型的皮肤及神经系统损害以外，多具有多器官损害的特征，如心肌损害等，重型者死亡率较高，既往研究发现，在手足口病患儿血清及体液中免疫因子及炎性因子表达异常，提示可能免疫过程参与手足口病的发病及进展过程，而且在手足口病患儿体内存在Th细胞免疫漂移现象，Th1向Th2亚群分化导致的免疫抑制是手足口病患儿病情进展的机制之一[4.5]。

多种血清型的肠道病毒感染均能引起手足口病，其中EV71感染所致的手足口病是常见的类型之一，在对EV71感染所致的手足口病患儿研究发现，在患儿体内存在细胞免疫及体液免疫异常情况，患儿感染手足口病后，其体内的Th及Ts淋巴细胞的数量均明显下降，B细胞数量升高[6]。Th细胞具有诱导免疫细胞活化及应答的作用，是机体维持正常细胞免疫的主要机制之一[7.8]。Ts细胞对Th的活化及B细胞活化具有调节作用，Th及Ts细胞与患者细胞免疫关系最为密切，Th及Ts细胞的下降说明患者细胞免疫功能受到抑制。而且与患儿手足口病的病情程度相关，重症组患儿细胞免疫抑制情况更为明显[9，10]。进一步的研究发现，在手足口病患儿体内存在过度炎症反应现象，TNF-α、IL-6 及IL-10过度表达，TNF-α、IL-6 及IL-10均是由活化的免疫细胞释放的介质，TNF-α和IL-6具有强烈的导致炎症反应的作用，能够导致组织、器官的炎性损伤甚至功能衰竭、组织坏死，同时TNF-α和IL-6对中性粒细胞及巨噬细胞等炎性细胞具有趋化及激活作用，能够导致局部炎性细胞的聚集及炎症反应，IL-10主要有Th2细胞、B细胞及巨噬细胞表达的细胞因子，是对T细胞免疫具有调节作用的炎性因子，能够反馈性抑制Th2细胞的表达，调节Th细胞免疫平衡及抑制过度的免疫反应，IL-10的过度表达提示患者体内存在Th2细胞的过度表达及漂移现象，说明存在细胞免疫的异常。

免疫球蛋白可使补体成分激活及体液免疫增强，研究中发现，患儿体内的IgA、IgG水平及补体C3、C4水平明显升高。IgA、IgG的表达水平升高说明机体的体液免疫功能增强。IgA、IgG对巨噬细胞及自然杀伤细胞的免疫吞噬作用具有增强作用，IgA尚能够通过经典途径激活补体系统，增强机体免疫反应，C3、C4等补体是体内正常表达的肽类分子，通过B细胞等免疫细胞对抗原的提呈作用激活，引起对外来抗原的识别及结合，参与机体的非特异性免疫[11]，研究结果显示，手足口病患儿存在体液免疫亢进的情况，而且同病情相关，重症患儿表现更为明显，其可能是手足口病患儿机体防御的主要表现[12]。既往研究显示[13]，在手足口病患儿的早期病程中IgM升高，病程第2天以后，IgM的升高的检出率明显下降，在检测过程中发现IgM在手足口病患儿中无明显变化，可能同患儿的病程有关[14，15]。研究结果显示，手足口病患儿细胞免疫功能抑制，体液免疫功能激活，同患儿的疾病进展程度相关，其主要原因可能与患儿病情进展及康复的过程体内免疫异常有关。

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（收稿日期：2013-01-22）