有核细胞计数范文
时间：2023-10-30 00:02:27
有核细胞计数篇1
当前，由于三分类、五分类血细胞分析仪的普遍应用，有些医院的检验科就不再进行血涂片镜检，这样很容易漏检造成误诊。本文着重探讨血涂片检查的重要性。
1 复核血细胞分析仪计数是否正确
由于血细胞分析仪的计数可受很多因素影响，不可能使每项参数都完全正确，所以进行血涂片镜检的重要作用不能忽视。使用血细胞分析仪时，应对每例患者都作血涂片镜检，从血涂片中细胞分布情况，可大致估计血细胞数，因而可对照血细胞分析仪计数是否正确，以保证计数质量。
1.1 对白细胞计数的复核 笔者曾遇一重症肝炎患者，血细胞分析仪计数白细胞异常增高，而血涂片中白细胞分布正常；后经手工计数，白细胞在正常范围，考虑可能是高胆红素血症干扰仪器计数所致。采用生理盐水洗涤，再重新计数，结果正常。由于同时作血涂片的检查，使错误得以及时纠正。血细胞分析仪对白细胞计数的干扰因素可有：巨大血小板、血小板凝块、有核红细胞、溶血素、工作温度等，造成白细胞假性升高或降低，故用血涂片进行复核很有必要。
1.2 对白细胞分类的复核 仪器对细胞分类是基本白细胞在加入溶血素后体积变化来区分，分类比较粗糙，只是一种过筛手段，与传统分类不同，传统手工分类是按基本细胞形态来分类的。目前，血细胞分析仪尚不能明确区分幼稚细胞、嗜酸性或嗜碱性粒细胞和单核细胞，也不能识别异型淋巴细胞等［1］。因此，进行镜检分类是必不可少的，它是保证细胞分类正确的基础。目前尚无一种自动化血细胞分析仪可以代替手工涂片。
1.3 血小板计数的复核 用血涂片进行血小板数复核，需要有丰富的经验，仔细观察血涂片中血小板的形态及分布，如血小板数量正常而形态不正常，可进一步作血小板功能方面的检查。如血小板数与仪器计数有出入，可能因素有：血小板凝集、细胞碎片、纤维蛋白、小红细胞(体积＜30 fl)、标本放置时间过长等，均可严重干扰血小板计数。
2 通过血涂片，并结合血细胞分析仪的各项参数及报警信号，可为临床提供有价值的资料
2.1 根据白细胞参数及直方图，结合血涂片检查分析，可发现更有价值的资料 当参数的直方图提示中性粒细胞数异常时，血涂片检查应特别注意中性粒细胞是否有形态异常，如核左移常伴有中毒颗粒、空泡变性，是否有原始和幼稚细胞等，如中性粒细胞5叶核以上者超过3%则为核右移，为造血功能衰退或缺乏造血物质所致。当参数和直方图提示中间细胞数异常时，血涂片检查就应特别注意嗜酸性、嗜碱性粒细胞和单核细胞的形态变化及其所占比例，注意是否有原始或幼稚细胞。在实际工作中也可发现，白细胞总数在正常范围内的白血病，如果不作血涂片检查，往往易漏诊。当直方图和参数提示淋巴细胞异常时，血涂片检查应特别注意有无异型淋巴细胞，有无原始和幼稚淋巴细胞等。
2.2 根据红细胞参数及直方图，结合血涂片，可为贫血的鉴别诊断提供有价值的依据，这时平均红细胞体积(mcv)均小于正常对照值，红细胞体积分布宽度(rdw)大于正常对照值。红细胞大小不均，大红细胞及巨红细胞易见到，生理性中心浅染区常消失，可见多色性及有核红细胞为巨幼红细胞性贫血，mcv和rdw均高于正常对照组。镜下见许多正色素性和低色素性红细胞则多见于缺铁粒幼细胞性贫血。以上各种原因的贫血均为造血原料不足或利用障碍引起。若见靶形红细胞，rdw为正常范围，则为地中海贫血。在溶血性贫血和再生障碍性贫血中，红细胞形态可大致正常，若易见嗜多色性红细胞，亦可见到有核红细胞，且rdw大于正常对照时，可推断为溶血性贫血；否则，可推断为再生障碍性贫血，并观察到粒细胞和血小板皆少。此外，镰形红细胞可见于血红蛋白s病，口形红细胞常见于遗传性口形红细胞增多症；脾切除患者的红细胞中可见多数棘细胞；在遗传性椭圆形红细胞增多症的血涂片中，椭圆形红细胞可在25%以上；红细胞碎片或不完整的红细胞，在弥漫性血管内凝血、微血管溶血性贫血、重型地中海贫血时出现较多。
3 血涂片镜检可检查寄生虫
临床上常遇到不规则发热的疟疾患者，往往被误诊或漏诊，在临床医师并未怀疑的情况下，由检验人员在血涂片中查见疟原虫而确诊，而血细胞分析仪就无此功能。
【参考文献】
有核细胞计数篇2
关键词: 鼻咽肿瘤;预后;增殖细胞核抗原;AgNoRs
1 材料和方法
1.1 材料 选取南方医院耳鼻咽喉科1980/1993鼻咽部活检组织的存档蜡块共计100例.病理诊断为鼻咽粘膜炎症22例，鼻咽癌78例，其中病理分化Ⅰ级者19例，分化Ⅱ级者20例，分化Ⅲ级者20例，泡状核细胞癌19例.
1.2 方法 免疫组化染色采用LAS-SP方法，第1抗体为鼠抗人PCNA单克隆抗体PC10（美国ZYMED公司产品），工作液稀释度1∶200;第2，第3抗体采用MOSP Kit试剂盒（美国ZYMED公司产品），工作液均稀释为1∶300.每例染片3张，包括阴性对照，PCNA染色并进行苏木精染色，复染结果用于计数增殖指数.AgNoRs染色选用高进介绍的一步法［1，2］ .PCNA染色结果判定是选择切片中最有代表性的视野.多例计数1000个癌细胞中PCNA的阳性细胞核数，按下列合成计算增殖指数（PI）:增殖指数（PI）=（阳性细胞数/1000）×100%.炎症粘膜中不计数炎性细胞和淋巴结反应中心细胞的阳性核数.PI≤0.05者视为阴性，在本研究中只对PI>0.05者进行讨论.AgNoRs染色后，应用LUZEX-F型图像分析系统，40倍镜下测定并打印100个癌细胞核内所含的AgNoRs总数，不同大小直径的颗粒数（C≥2.5μm按5个颗粒换算），颗粒总面积（AgNoRs总面积/100核）的值.
2 结果
2.1 细胞增殖指数（PI）、AgNoRs计数、图像分析结果 根据NPC病理改变将NPC病例分为5个组，PI，AgNoRs计数、图像分析结果各组有差异（表1）.
表1 炎症鼻咽粘膜与NPC各型PI，AgNoRs计数、图像分析结果 （略）
统计结果显示，病理分化Ⅰ级者、分化Ⅱ级者与分化Ⅲ级者各组之间PI差异有显著性，即随病理上恶性度的增高，PI亦增大.但泡状核细胞癌与病理分化Ⅲ级者之间无差别，病理上其恶性度与分化Ⅲ级者之间也很相近.
2.2 NPC组织中PCNA阳性细胞的分布情况 PCNA呈棕褐色的阳性反应，绝大多数PCNA阳性染色定位于细胞核，呈棕褐色颗粒或弥漫性分布，胞质几乎无表达，粘膜炎症及阴性对照无表达.鼻咽癌分化Ⅰ级者阳性细胞散在分布，棕色颗粒较均匀地分布于细胞核内，但染色较浅;分化Ⅱ级者阳性细胞数目较多，染色较深，棕色颗粒在核内分布也较均匀;分化Ⅲ级者阳性细胞数目多，分布密集，染色深;泡状核细胞癌阳性细胞表达较多，但着色浅，棕色颗粒在核内呈网状分布.
2.3 PI指数与鼻咽癌预后的关系 我们将每位患者（均行放射治疗）追踪随访资料整理分析，其中有46例随访到5a，通过寿命表法计算出5a生存率，病理分化Ⅰ级者为75%，分化Ⅱ级者为73%，分化Ⅲ级者为61%，泡状核细胞癌组为65%.统计结果显示，细胞增殖指数与5a生存率呈负相关，即细胞增殖指数高，5a生存率则降低（P
2.4 AgNoRs染色图像分布情况 鼻咽部炎症粘膜组织的AgNoRs形态可见核仁区个别AgNoRs团块，细胞核中银染颗粒分布少而且直径很小;鳞癌细胞核AgNoRs颗粒甚为丰富，散在于核内，大小不等形状不规则，有的甚至形成聚集区，多以核仁型和弥散型为主，随细胞分化程度的逐步降低，胞内AgNoRs颗粒≥2.5μm的逐步增多;泡状核细胞癌呈弥散分布，且表达量较鳞癌相对较少.随统计结果可以看出，Ag-NoRs计数与总面积随分化的增高而减少. 2.5 AgNoRs颗粒计数结果与NPC预后关系 分析Ag-NoRs计数与NPC预后关系随访资料，其中有40例记录到5a，包括目前患者状况，计算5a生存率，病理分化Ⅰ级者72%，分化Ⅱ级者69%，分化Ⅲ级者为60%，泡状核细胞癌组为63%.统计结果显示，AgNoRs计数与总面积与5a生存率呈负相关，即AgNoRs计数越大，5a生存率越低（P
上述结果表明NPC中PCNA的表达与AgNoRs计数在判定NPC的分化程度与预后方面存在明显相关性.
3 讨论
PCNA又称周期素，是一种30ku酸性无组蛋白的细胞核多肽，其免疫反应多局限于增殖细胞的核内，胞质很少或没有，已被证明它的合成与增殖细胞的增殖周期有关，G期在核内表达逐渐增多，S期达高峰，而G/M期很少
［3，4］ .本研究亦证实PCNA几乎只表达于NPC的细胞核内，且不是所有的癌细胞均表达，从增殖指数的统计结果可以看出，其表达率与病理分级呈正相关，即病理上恶性度越高，则PCNA表达的阳性细胞数量越多.AgNoRs作为调节rDNA转录活动的蛋白，其计数增加与细胞增殖活跃、DNA倍体增加及rDNA转录活性有关［5，6］ .多数作者认为，AgNoRs计数的主要临床意义在于区分良、恶性病变，而我们的结果表明AgNoRs计数对于区分NPC病理恶性度有统计学的相关性.对于泡状核细胞癌的PCNA表达与AgNoRs计数与未分化癌的不一致，可能与其病理形态有关，因其核的大部分呈空泡状，无实质之故，不过在临床预后上，许多病例已说明，泡状核细胞癌预后都要较未分化癌好，从侧面说明泡状核细胞癌恶性度要较未分化癌弱.本实验表明:NPC的PCNA表达、AgNoRs染色图像分析的结果与NPC的分化及预后有明显的相关性，这在PI与图像分析后的AgNoRs计数和AgNoRs总面积在NPC的组织分型，分化程度以及预后等方面都得到证实.二者不仅可用于NPC恶性度的判别，而且对NPC的预后亦有提示作用.
参考文献
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有核细胞计数篇3
【关键词】 多发性骨髓瘤；反应性浆细胞增多症； 骨髓细胞形态学
【Abstract】 Objective To investigate characteristics of cell morphology in multiple myeloma （MM） and reactive plasmacytosis （RP）， in order to improve identification of this two diseases. Methods Microscopic examination was made for blood smear and bone marrow smear of MM and RP after stained by Wright's stain. Arrangement of erythrocyte and form of plasmocyte were observed. Differential counting required 100 karyocytes in blood smear and 500 karyocytes in bone marrow smear for calculating proportion of plasmocyte. Results MM patients had visible plasmocyte and rouleanx erythrocyte in peripheral blood， with a large amount of marrow plasmocyte. Their plasmocyte was in cluster distribution with obvious nuclear abnormality. RP patients had few plasmocyte and unobvious rouleanx erythrocyte in peripheral blood， with a few marrow plasmocyte. Their nuclear abnormality was not obvious， and plasmocyte was in scattered distribution. Conlcusion MM and RP show similarity in cell morphology， and that may lead to misdiagnosis. Bone marrow cell morphology is the basis for diagnosis of these two diseases.
【Key words】 Multiple myeloma； Reactive plasmacytosis； Bone marrow cell morphology
MM的发病率逐年增高， 且被认为是一种不可治愈的疾病。因此， 早期诊断， 早期治疗， 是延长生存期的重要途径[1， 2]。MM是骨髓内单一浆细胞株异常增生的一种恶性肿瘤， 其特点是单克隆浆细胞恶性增殖并分泌过量的单克隆免疫球蛋白（M蛋白）， 正常多克隆浆细胞的增生和多克隆免疫球蛋白分泌受到抑制， 从而引起贫血、感染、出血及广泛骨质破坏等一系列临床表现[3]。RP是由于各种原发疾病引起的继发性骨髓浆细胞增多， 其临床表现与原发疾病有关， 而并非由浆细胞增多本身或其分泌的免疫球蛋白所引起[4]。二者诊断不易区分， 均以血片、骨髓片中浆细胞数量和细胞形态学特点为诊断重要依据[5]。现回顾性分析本院近年来已确诊的25例MM及30例RP患者血片及骨髓细胞形态学检查结果， 现报告如下。
1 资料与方法
1. 1 一般资料 MM患者25例， 男22例， 女3例， 年龄54～85岁， 中位年龄62岁；其中IgG型18例， IgA型2例， IgD型1例， IgE型2例， IgM型2例。RP患者30例， 男17例， 女13例， 年龄34～70岁， 中位年龄46岁， 其中缺铁性贫血5例， 巨幼红细胞性贫血4例， 粒细胞缺乏症5例， 血小板减少性紫癜4例， 恶性淋巴瘤1例， 过敏性紫癜2例。感染性疾病7例， 类风湿关节炎2例， 所有MM和RP符合诊断标准[1]。
1. 2 实验室检查
1. 2. 1 MM患者血常规 血红蛋白（ Hb）：65～100 g/L， 平均75 g/L；红细胞（RBC）：（1.26～3.53） ×1012/L， 平均2.17×1012/L；血小板（ PLT） ：（62～289）×109/L， 平均91×109/L；白细胞（WBC）：（2.1～14.9）×109/L， 平均3.05×109/L；红细胞沉降率（ESR）：80～163 mm/h， 平均136 mm/h；蛋白电泳有M带21例 。
1. 2. 2 RP患者血常规 Hb： 95～142 g/ L 平均115 g/L；RBC：（3.18～5.23）×1012/L， 平均 3.98×1012/L；PLT：（91～357） ×109/L， 平均154×109/L；WBC：（3.07～21.8）×109/L， 平均7.2×109/L； ESR：2～34 mm/h， 平均14 mm/h；蛋白电泳有M带0例。
1. 3 方法 收集25例MM和30例RP患者临床及实验室相关资料进行整理分析， 血片及骨髓片经瑞氏染色， 血片观察100个有核细胞， 骨髓片观察500个有核细胞， 计数浆细胞比例并观察其形态特点， 骨髓成像系统采用国联在线图文应用软件。
1. 4 统计学方法 采用SPSS15.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P
2 结果
2. 1 临床表现 25例MM中有15例患者出现发热， 30例RP中有19例患者出现发热， 两者比较， 差异无统计学意义（P>0.05）。MM患者出现骨痛19例， 贫血25例， 而RP出现骨痛3例， 贫血6例， 差异有统计学意义（P0.05）。
2. 2 外周血细胞形态 25例MM中有8例外周血出现浆细胞， 浆细胞百分比为1%～15%， 而30例RP无一例外周血出现浆细胞， MM外周血红细胞呈缗钱状排列23例， 而RP患者外周血红细胞呈缗钱状排列1例。MM血细胞分类中出现有核红细胞5例， 而RP患者1例。
2. 3 骨髓细胞学检查 MM患者骨髓增生极度活跃2例， 增生明显活跃18， 增生活跃5例， 而RP患者骨髓增生极度活跃1例， 增生明显活跃19例， 增生活跃8例， 增生低下2例。MM骨髓浆细胞占有核细胞数（20±3）%， 而RP患者浆细胞占有核细胞数（5.0±2.5）%， 两者差异有统计学意义（P
3 讨论
3. 1 MM是以骨髓内浆细胞恶性增生， 分泌单克隆免疫球蛋白或轻链， 临床特征为骨痛、病理性骨折， 贫血、肾功能损害， 并伴有正常免疫球蛋白减少以及广泛溶骨病变和骨质疏松为特征的肿瘤。它常见于中、老年人， 发病年龄多在50～60岁之间， 既往曾误认为MM是一种少见病， 近年来， 随着人口的老龄化和人们对此病认识及诊断水平的提高， MM病例数显著增加， 发病率明显升高。目前在我国无MM的流行病学资料， 但随着我国人口老龄化的发展， MM的发病率逐年增高， 对我国人口的健康构成有越来越严重的威胁。而RP是继发的， 可见于不同年龄的患者， 临床表现主要与原发疾病有关， 而并非由浆细胞增多本身或其分泌的免疫球蛋白所引起[6]。骨髓细胞形态学检查是鉴别二者的重要依据之一， 其对MM的诊断和治疗疗效监测具有重要的临床应用价值， 且具有广泛开展的必要性。
3. 2 MM患者血片可见到浆细胞， 红细胞呈缗钱状排列， 骨髓浆细胞数多， 双核、多核易见， 可见浆细胞成簇分布[7]。而RP患者血片浆细胞少见， 红细胞排列均匀， 骨髓浆细胞数量较少， 核异型性不明显， 浆细胞散在分布[8]。
3. 3 浆细胞应注意与中幼红细胞及小淋巴细胞鉴别 瘤细胞分型Ⅰ型为小浆细胞型：细胞较成熟， 染色质致密， 核偏位， 胞浆丰富。Ⅱ型为幼稚浆细胞型：胞核染色质疏松， 细胞外形尚规整， 核偏位。Ⅲ型为原始浆细胞型：核染色质疏松， 如网状细胞， 核可居中， 有核仁。Ⅳ型为网状细胞型：细胞形态多样化， 核仁较大、较多， 恶性程度高[9]。
3. 4 骨髓细胞形态学检查是诊断MM与RP的基础， 血清学和尿液的蛋白检测为鉴别二者提供了有效的依据， 随着单克隆抗体技术的发展， 流式细胞仪检测浆细胞膜上的抗原表达， 为二者的鉴别上升到分子学诊断水平。骨髓瘤细胞表型为：CD38+、CD138+、CD19-、CD56+， 而正常浆细胞免疫表型为：CD38+、CD138+、CD19+、CD56-[10]。因此二者需紧密结合综合分析， 为临床诊断提供更加可靠的依据。
参考文献
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有核细胞计数篇4
[关键词] 超敏C—反应蛋白；单核细胞；炎症；相关性
[中图分类号] R541.4 [文献标识码] B [文章编号] 1673—9701（2012）27—0136—02
The correlation of serum high sensitive C—reactive protein and monocyte in inflammatory response
PENG Lei HE Aimin
Department of Clinical Laboratory，the People’s Hospital of Xinyu City in Jiangxi Province，Xinyu 338000，China
[Abstract] Objective To discuss the correlation of serum high sensitive C—reactive protein and mononuclear cell in inflammatory reaction. Methods All 1 000 cases for examining hs—CRP levels were divided into observation group with serum hs—CRP levels increased significantly and control group with hs—CRP normal， each 500 cases. The white blood cell counting and classification， the mononuclear cell percentage was assayed， observed and compared in both groups. Results Blood routine test showed that monocytosis in 479 cases of observation group （Mon%=95.8%）， and mononuclear cell percentage was normal in 485 cases of control group （Mon%= 97.0%）. Conclusion hs—CRP is obviously associated with MON. The mononuclear cell percentage is rising with serum hs—CRP levels increased.
[Key words] High sensitive C—reactive protein；Monocyte；Inflammation；Correlation
单核细胞来源于骨髓中的造血干细胞，并在骨髓中发育。单核细胞是主要的炎性细胞之一，进入组织后成为巨噬细胞，单核巨噬细胞是炎性细胞因子的主要来源细胞。激活了的单核细胞和组织巨噬细胞能生成并释放多种细胞毒、干扰素和白细胞介素，参与机体防卫机制，单核细胞能吞噬异物产生抗体，在机体损伤治愈、抗御病原的入侵和对疾病的免疫方面起着重要的作用。机体发生炎症或其他疾病都可引起单核细胞总数百分比发生变化，因此检查单核细胞计数成为辅助诊断的一种重要方法。
1资料与方法
1.1一般资料
选取2011年来我院检查血清超敏C—反应蛋白（hs—CRP）升高患者500例作为CRP升高组，其中男291例，女209例，平均年龄（50.8±9.2）岁；另选血清hs—CRP正常患者500例作为对照组，无血液遗传病家族史；其中男274例，女226例，平均年龄（53.2±10.4）岁；排除白血病患者及相关血液性疾病、恶性肿瘤及6个月内有外伤、手术、精神刺激等应激史者。采取静脉血标本前均未服用还原酶抑制剂、非甾体解热镇痛药等药物。
1.2 仪器与试剂
免疫荧光干式定量法，仪器为韩国Boditech MED Inc公司生产的i—CHROMA Reader免疫荧光分析仪。采用Sysmex XS—800i血细胞分析仪。试剂均用原厂配套试剂及质控品。严格按照说明书操作。
1.3方法
EDTA试管抽取静脉血2 mL，进行血细胞分析（Sysmex XS—800i）后，3 000 r/min离心10 min，吸10 μL 血浆，hs—CRP测定（i—CHROMA Reader）。
1.4 统计学处理
采用SPSS13.0统计学软件进行分析。计数资料采用χ2检验；计量资料以（x±s）表示。组间均数比较采用 t 检验。各指标间的相关性分析采用偏相关分析。P
2 结果
2.1 两组的hs—CRP与单核细胞比较
见表1。hs—CRP、单核细胞分数（Mon%）正常参考值分别为
表1 两组的hs—CRP与单核细胞比较
有核细胞计数篇5
【关键词】鳞状细胞癌;端粒酶逆转录酶(hTERT);Tca8113细胞;细胞凋亡
The effect of antisense oligodeoxynucleotides against hTERT on apoptosis of human tongue squamous cell carcinoma
LIU Zhihui1CHEN Shunyue1 WANG Huiming2
【Abstract】Objective: To investigate the effect of antisense oligodeoxynucleotides against hTERT on apoptosis of human tongue squamous cell carcinoma.Method: Tca8113 cells in culture medium were treated with different concentrations of antisense oligedeoxynucleotide of hTERT, were detectd by MTT assay, FCM analysis, DNA ladder test, RT-PCR. Sense oligedeoxynucleotide ofhTERT, blank carrier, and blank cuture medium respectively were served as control groups. Results: The P values of the ratio of cell apoptosis and the S phase of cell cycle were less than 0.05 between the experimental group and control groups, both of the P valueswere considered significant (p
【Key words】squamous cell carcinoma, human telomerase reverse transcriptase subunit(hTERT) , Tca8113 cell line, cell apoptosis
【中图分类号】R44.6【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2010)009-0001-03
端粒酶是肿瘤发生、发展关键步骤。其中,端粒酶逆转录酶基因又称端粒酶催化亚基(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因作为端粒酶三大组分之一,是决定端粒酶活性的关键性分子,它在端粒酶活性失控、肿瘤形成中起重要作用。国内外采用反义hTERT或(和)反义端粒酶RNA(telomerase RNA,hTR)技术逆转了淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、腺样囊性癌细胞恶性表型[1~5]。但目前关于反义hTERT抑制舌癌细胞增殖、诱导凋亡报道较少。本实验采用脂质体作介导,用端粒酶逆转录酶基因作为分子靶点,将反义hTERT基因导入口腔鳞癌Tca8113细胞,观察其对细胞生物学行为的影响,探讨hTERT作为靶点治疗舌癌的可行性。
1 材料与方法
实验材料。
1.1 实验细胞株。人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113细胞,由上海第二医科大学附属第九人民医院口腔生物研究室建系并提供。
1.2 实验主要试剂及药品。RPMI1640培养基(美国GibcoBRL公司),特级小牛血清(杭州四季青生物工程公司)。小量凋亡DNA抽提纯化试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)。脂质体(OligofectAMINE(TM)Reagent,Invitrogen公司,美国)。Annexin V FITC检测试剂盒(Coulter公司,美国)。碘化丙锭(Sigma 公司产品)。细胞总RNA抽提试剂TRIzol(Invitrogen公司,美国)。
2 方法
2.1 细胞培养。Tca8113细胞生长于RPMI1640培养液中,内含体积分数为10%小牛血清,于37℃、体积分数为5% CO2的饱和湿度孵箱中培养。3天换液传代一次,取对数生长期细胞做后续实验。
2.2 细胞增殖检测―MTT试验。取对数生长期的Tca8113细胞,分别按寡核苷酸浓度0.5,1.0,2.0μmol/L加入每孔,均设3复孔。另设一个调零孔(只含培养液,不含细胞和药物)。置培养箱37℃培养后第24、48、72h,每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL。37℃培养4h后,离心倾去上清,每孔加入DMSO 200μL。于30min内在酶标仪上读取吸光度值OD570nm,每孔测3次,计算细胞增殖抑制率。
2.3 细胞DNA ladder(凋亡梯子)检测。细胞小量凋亡DNA的抽提纯化,严格按照试剂盒说明进行。DNA产物琼脂糖凝胶电泳分析:取10μL DNA,50mV,在2.0%琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭)上电泳1h,凝胶成像分析仪摄影,KODAK图象分析系统摄片。
2.4反义寡核苷酸的设计与转染。选择人hTERT mRNA 3584~3565bp,作为靶位点合成与之互补的反义寡核苷酸(ASODN),同时设序列与靶位相同的正义寡核苷酸(SODN)为对照。寡核苷酸序列如下: ASODN:5'ACT CAC TCA GGC CTC AGA CT 3' 分子量为6020
SODN:5'AGT CTG AGG CCT GAG TGA GT 3' 分子量为6206经计算机检索证实与其他已知的人类基因无同源性。由上海生物工程公司合成纯化,寡核苷酸的碱基均进行全硫代修饰。
寡核苷酸的转染:参照说明书进行。每组每个浓度设3个平衡复孔,并设空白对照(不加任何寡核苷酸)和转染相应浓度ODN时所需的空载体对照,分别命名为空白培养基组、空载体0.5μM、1.0μM和2.0μM组。
2.5 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Tca8113细胞中CyclinD1和Bcl-2 mRNA 的表达采用RT-PCR法。
用TRIZOL溶液提取细胞总RNA。
温度循环按表中进行。
经2.0%的琼脂糖,将PCR产物10μL,在电压为100V的条件下电泳30min。紫外线下观察并经Kodak Digital系统成像。将目的基因条带与β-actin条带的密度扫描值比值作为目的基因的表达相对水平。
2.6 细胞凋亡检测。调整待测细胞的浓度为5×105-1×106个/mL,700rpm,4℃离心5min,按 AnnexinV-FITC检测试剂盒说明分别加入Binding Buffer、AnnexinV 和5μLPI,避光室温反应15min,在1h内上机检测。
2.7 细胞周期检测。待测样本制成单细胞悬液,用预冷的70%冷乙醇固定,过夜,加入RNase A(终浓度为20μg/mL),37℃孵育30min,重悬于1mL PI染液(终浓度为50μg/mL),4℃避光1h,上机检测,资料用cell Quest细胞周期分析软件处理。
3 统计学处理
所得实验数据以均数±标准差表示,所有数据应用SPSS11.0 for windows统计软件进行处理,组间差异比较采用ANOVA单因素方差分析,以P
4 结果
4.1反义寡核苷酸对Tca8113细胞增殖的影响(OD570nm,±SD)反义寡核苷酸组Tca8113细胞增殖减慢,0.5μM组细胞尚能缓慢增殖,2.0μM组细胞基本无明显增殖,在加反义寡核苷酸72h后,细胞数量低于接种24h时数量。正义寡核苷酸组、空载体组各浓度组和空白培养基组Tca8113细胞随培养时间延长呈指数增长,不受影响。见图1。
图1 各组Tca8113细胞增殖曲线
4.2 反义寡核苷酸对Tca8113细胞周期和凋亡的影响。
4.2 细胞形态学变化。在倒置显微镜下观察,反义寡核苷酸组细胞随作用时间和作用浓度的增加,贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落;细胞间隙增大,部分细胞核深染,胞膜皱缩,细胞形态呈圆形或椭圆形,作用72h效应较明显。2.0μM反义寡核苷酸组可见细胞凋亡特征性的细胞膜完整但周围出现颗粒的发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。正义寡核苷酸组、空载体组各浓度组和空白培养基组间培养72h后连接紧密,分裂活跃,细胞为多边形,触角外展,细胞巢团状分布,无细胞发泡现象,未见凋亡小体。
4.3 DNA ladder琼脂糖凝胶电泳分析。24h时,各组细胞的DNA ladder(“梯状”条带)不明显。反义寡核苷酸组2.0μM在48h时即检测到清晰的细胞凋亡特征性的DNA ladder,72h时,0.5μM、1.0μM和2.0μM反义寡核苷酸均可检测到该梯状条带。正义寡核苷酸组、空载体组各浓度组和空白培养基组间在三个时间点均未检测到DNA ladder,只在加样孔附近出现明亮的大分子单一条带。
4.4 流式细胞仪法检测细胞凋亡率变化。0.5μM~2.0μM 反义寡核苷酸转染Tca8113细胞培养72h后,与空白对照组比较,Annexin-V /碘化丙锭双染色法检测到细胞早期凋亡率增加,反义寡核苷酸诱导的细胞凋亡率随反义寡核苷酸浓度和培养时间的增加而增高。正义寡核苷酸组、空载体组各浓度组虽随时间增加出现凋亡率略增高,但与空白培养基组无差异。
ANOVA分析,F=75.386,*与空白组比较,P0.05。
4.5 流式细胞仪法检测Tca8113细胞周期。如表3所示,反义寡核苷酸组细胞G0/G1期细胞比率上升,S期细胞比例下降,说明细胞在反义寡核苷酸作用下,细胞周期阻滞在G0/G1期,与正义寡核苷酸组、空载体组和空白培养基组比较有差异(P
ANOVA分析,F=3.357,*与空白组比较,P0.05。
5 讨论
近年来,端粒酶与恶性肿瘤的高度相关性引起人们的极大兴趣,成为肿瘤领域的研究热点之一。新近较多研究表明抗hTERT能够抑制肝癌、肺癌、白血病和前列腺癌等恶性肿瘤的生长[6~9]。然而,有关抗端粒酶途径治疗口腔鳞癌目前鲜有报道。为进一步探讨抗端粒酶逆转录酶途径治疗舌癌的可行性,并了解其作用的可能机制,我们在本研究中观察了靶向hTERT的反义寡核苷酸对Tca8113细胞增殖和和凋亡的影响,对这一作用相关的分子事件作了一些探索。
反义技术作为基因“封条”,能够特异性封闭或抑制其靶基因的表达。但是,不同的研究针对的靶点不同,有以模板区为靶点,有以启动子区为靶点,其效用也存在分歧。本研究针对hTERT基因设计合成含20个碱基的硫代寡核苷酸,证实反义寡核苷酸在体外对Tca8113 细胞的增殖有明显的抑制作用,此抑制作用呈现一定的浓度和作用时间相关性。本研究中反义寡核苷酸0.5μM时Tca8113增殖出现一定的抑制,但并没有出现细胞大量凋亡的现象,而2.0μM反义寡核苷酸作用48h开始,细胞出现负增长。本研究中也发现一个现象,细胞若继续培养到96h再经过换液培养后,细胞数量并没有出现全面死亡,存留的少量细胞会出现重新分裂、繁殖。这可能是因为:1. 反义寡核苷酸对Tca8113细胞作用有一个有效作用浓度和时间[10]。反义寡核苷酸有瞬间释放的效应,96h后有少量细胞逃脱凋亡的细胞重新分裂繁殖,引发残余肿瘤复发的危机。这现象提示反义hTERT应该重复或多次给药。另外,采取构建质粒的方法,也能持续产生反义序列,但这种方法用于体内可能会造成生物污染,如病毒的转入等[11]。2. 端粒酶抑制剂作为一种快速有效的抗肿瘤方法并不能单独使用。多数研究认为端粒酶hTERT是肿瘤发生发展的必需前提,但不是唯一条件。与顺铂或反义c-Myc基因等联合治疗肿瘤将更彻底杀灭肿瘤细胞。在肿瘤研究领域,可以将反义技术和常规治疗方法相结合,提升治疗肿瘤细胞的综合能力[12]。
本研究的反义寡核苷酸针对hTERT基因3'端非编码区,这一区域为mRNA的不稳定部位,对Tca8113细胞的hTERT和增殖有较强的抑制作用。反义寡核苷酸抑瘤作用存在序列相关性。Kraemer设计了针对5个不同位点的23条反义hTERT寡核苷酸作用于膀胱癌EJ28细胞,发现5条有抑制作用,对hTERT的最高抑制率达88%,细胞增殖抑制率为67%[13]。本研究也发现,该反义片段抑制Tca8113细胞增殖作用有序列特异性。正义序列与寡核苷酸的GC含量一致,但正义寡核苷酸对Tca8113细胞增殖无明显影响。而部分研究认为正义序列能较空白对照促进细胞增殖,引起hTERT的过表达,这可能与反义寡核苷酸序列的靶位设计有关。
从形态学观察,贴壁的细胞出现增殖能力减弱的改变,包括变圆、脱落,连接松弛,细胞体积变小和细胞膜完整的发泡现象等。正义组、空载体组和空白培养基组却没有类似改变。流式细胞仪结果证实反义组细胞增殖受抑,发生凋亡的现象。反义寡核苷酸组Tca8113细胞S期细胞比例下降,G0/G1期细胞比例较对照组增加。虽然反义寡核苷酸组没有检测到明显的亚G1峰,但早期凋亡率出现上升。
综上所述,本研究表明,诱导细胞凋亡是靶向hTERT反义寡核苷酸引起Tca8113细胞增殖抑制的途径之一。随着反义技术迅速发展,人类基因组计划的完成,将可能出现新的更富杀伤力的基因,这会给反义RNA治疗舌癌提供更大的用武之地。
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有核细胞计数篇6
【摘要】 本研究探讨多种细胞因子（TPO、SCF、FL、IL-1、IL-3、IL-6）组合的几种培养体系对人外周血CD34+细胞体外诱导扩增生成巨核细胞的作用，研究人外周血来源的巨核细胞体外扩增的最佳细胞因子组合及培养时间。用Ficoll-Hapaque分离法分离动员的外周血（MPB）单个核细胞，免疫磁珠法分离纯化CD34+细胞，并将其在含胎牛血清的液体培养体系中、各组细胞因子诱导下培养15天。在不同时间点采用血细胞计数板进行细胞计数，采用流式细胞术检测培养体系中CD41+细胞的含量；同时采用甲基纤维素半固体培养法进行巨核细胞集落培养，测定巨核细胞集落形成单位（CFU-MK）的数量。结果表明：经过15天的培养，在MPB来源的CD34+细胞体外诱导并扩增巨核祖细胞体系中，以TPO/FL/IL-6/IL-3组合的扩增效果最好，明显高于其它3组，CD41+细胞第5天、10天分别扩增了93.97±17.27倍、131.23±18.26倍。第15天CD41+细胞含量及CD41+细胞数迅速下降。CFU-MK产率（/1×103个细胞）第5天、10天分别为83.33±10.02个、120.67±13.01个，明显高于其余3组。结论：以TPO/FL/IL-6/IL-3因子组合为体外诱导扩增巨核祖细胞的最佳组合，动员外周血的巨核祖细胞体外诱导扩增以培养第10天为宜。本实验建立了动员人外周血来源的巨核祖细胞体外扩增体系。
【关键词】 动员人外周血； 巨核祖细胞; 体外扩增；
Ex vivo Expansion of Megakaryocytic Progenitors from Mobilized Human Peripheral Blood
Abstract This study was aimed to investigate the effect of some culture system compased of various cytokine combinations (TPO，SCF，FL，IL-1，IL-3，IL-6) on ex vivo expansion of megakaryocytic progenitors inducced from CD34+ cells of peripheral blood and to seek a optimal cytokine combination and culture time. Mononuclear cells were isolated from mobilized peripheral blood (MPB) by density gradient centrifugation over Ficoll. CD34+ cells were purified by using an immunomagnetic bead separation system. The selected CD34+ cells were seeded in Iscove′ s modified Kulbecco′ s medium (IMDM) supplemented with fetal calf serum (FCS) and various kinds of cytokines. After 15 days of culture，the content of CD41+ cells in culture system were determined by flow cytometry，and the number of megakaryocyte colony-forming unit (CFU-MK) was measured simultaneously. The results showed that after definited days of culture，the cytokine combination TPO/FL/IL-6/IL-3 was the most suitable for MPB to obtain high number of MK，and better than any other three groups（P<0.05）. The increase multiple of CD41+ cells was 93.97±17.27 on day 5 and 131.23±18.26 on day 10. On day 15，the proportion and the increase multiple of CD41+ cells decreased obviously. The expansion multiples of CFU-MK were 93.33±10.02 on day 5 and 120.67±13.01 on day 10，higher than any other groups. It is concluded that TPO/FL/IL-6/IL-3 combination was the best optimal for expansion ex vivo of megakaryocytic progenitors from MPB，and its suitable duration of culture was 10 days; a culture system for expansion ex vivo of megakaryocytic progenitors have been established in this study.
Key words mobilized peripheral blood; megakargocyte； ex vivo expansion
造血干细胞移植或大剂量放、化疗后引起血小板减少，发生血小板缺乏症，严重时导致内脏出血、颅内出血，这是临床上肿瘤治疗中极需解决的问题。血小板的输入不仅有可能发生过敏反应和感染一些传染性疾病（肝炎及其它病毒感染）；而且反复多次的血小板输注会给患者家庭带来一定的经济负担和诱发血小板抗体的产生，导致血小板输注无效。输入体外扩增的富含巨核细胞的产品，能增加体内形成血小板的能力，以缩短血小板缺乏期。因此，巨核祖细胞的体外诱导扩增并回输就成为解决这一问题的有效途径之一［1］。动员后的外周血（mobilized peripheral blood，MPB）造血干／祖细胞（CD34+细胞）含量比单份脐血(CB)和骨髓(BM)中的高，来源丰富，且具有较强的造血重建能力。近10年来，随着细胞因子的分离纯化和克隆，人们已对巨核细胞体外扩增进行了深入研究，以待早日广泛应用于临床。本实验就外周血来源的CD34+细胞在体外定向诱导扩增巨核祖细胞的最佳体系进行研究。
材料和方法
标本来源
MPB来自南方医院血液内科及本科移植中心，用1 ml一次性无菌注射器收集MPB 0.4-0.6 ml，共收集5份标本。
主要材料
人重组粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF，吉粒芬300微克/支，购自杭州九源基因工程有限公司）。TPO、IL-1β、IL-3、FL、FITC标记的抗人CD41a、CD34抗体(美国Peprotech 公司产品)，IL-6、SCF(麒麟鲲鹏生物药业公司产品)；CD34+细胞分离试剂盒(德国Miltenyi Biotec公司产品)；淋巴细胞分离液 （比重：1.077 g/ml，购自达科为生物技术公司）、小牛血清白蛋白（BSA，购自上海生物工程有限公司）；IMDM、DPBS（美国Hyclone公司产品）；胎牛血清（购自杭州四季青公司）。
外周血CD34+细胞的动员和分离富集
给供者或患者皮下注射rhG-CSF 5-10 μg/（kg·d）连续7天。用PBS1将MPB调成细胞悬液，加于淋巴细胞分离液（比重：1.077 g/ml）中。离心后，吸取中间白膜状单个核细胞层，用PBS1洗2次，再用PBS2洗涤1次。测定细胞数，并根据计数结果调细胞浓度为108/0.3 ml。按108单个核细胞（MNC）∶100 μl的比例加入A(FcR blocking reagent)充分混匀，再加入B(CD34 microbeads)充分混匀，于6-12℃下孵育30分钟。用PBS2洗1次，过30 μm的滤膜。用PBS2将细胞悬液调成3 ml，在磁性条件下过柱分离CD34+细胞，脱离磁场充分冲洗柱子。细胞计数后，用流式细胞仪测定细胞分离纯度。
巨核祖细胞的体外扩增
将CD34+细胞浓度调整为2×104/ml，加入24孔板，每孔终体积为1 ml。按不同细胞因子组合分为4组。A组：TPO/SCF/IL-6；B组：TPO/SCF/IL-6/IL-1；C组：TPO/SCF/IL-6/IL-3；D组：TPO/FL/IL-3/IL-6，每组复种3孔。细胞因子的终浓度为：IL-1、IL-3、IL-6、FL为10 ng/ml，SCF为50 ng/ml，TPO为20 ng/ml，采用含10％FCS的IMDM培养体系。培养体系中含L-Glu(终浓度为2 mmol/L)和2-巯基乙醇（终浓度为1×10-4mol/L）和适量青霉素和链霉素。将上述扩增体系置37℃、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养，每3天半量换液1次，添加全量的造血生长因子，培养15天，分别测定第5、10和15天培养体系的总细胞数，流式细胞仪测定CD41+细胞的百分含量，然后按以下公式计算其扩增倍数。
dnCD41+细胞的扩增倍数=每孔的dn总细胞数×CD41+细胞的百分含量/2×104
巨核祖细胞集落培养
用甲基纤维素半固体培养法培养。悬浮培养一定时间之后的细胞按1×103种植于Petri培养皿（35 mm，Lux）中培养。甲基纤维素半固体培养体系包括：0.9%甲基纤维素、1％牛血清白蛋白（BSA），10-4 mol/L 2-巯基乙醇、20％胎牛血清（FCS）及TP0（20 ng/ml），IL-3（10 ng/ml)、IL-6（10 ng/ml），SCF（50 ng/ml），加上IMDM，使总量达1 ml。培养皿置于37℃，5％ CO2、饱和湿度培养箱中培养7-14天后原位固定，干燥后经瑞氏-姬姆萨染色标记细胞，采用倒置显微镜进行细胞集落计数。确认标准：每个CFU-MK至少含3个巨核细胞。
统计学分析
采用SPSS(V 12.0)软件包处理，进行多组间one-way ANOVA Test。P＜0.05为显著性差异。
结 果
外周血CD34+细胞的富集
将免疫磁珠分选富集后的细胞用流式细胞仪检测，得到的CD34+、CD41+细胞含量分别是(91.38±1.99)％、(3.04±0.39)％。CD34+细胞仅占正常成人外周血的0.05%-0.2％，经细胞因子和（或）化疗动员后，外周血中CD34+细胞的含量可达1%-2％，显示富集后的CD34+细胞含量明显提高，而CD41+细胞含量仍然较低。
外周血来源的巨核祖细胞体外扩增效果
在培养第5天，用流式细胞仪检测实验各细胞因子组合MPB中CD41+巨核细胞百分含量。以D组最高，为(29.50±2.29)％，明显高于A组（16.68±0.54）%、B组（22.90±1.64）%、C组（18.99±1.63）% ( P<0.05)，3组均较扩增前有极显著性差异(P<0.01)。D组CD41+细胞的扩增倍数为93.97±17.27，明显高于A组（20.15±4.60）、B组（72.24±19.90）、C组（54.92±9.68），具有显著性差异(P<0.01)。在培养第10天，各组CD41+巨核细胞所占比例较第5天减少，D组的CD4l+细胞含量仍明显高于A、B、D 3组(P<0.05)，D组CD41+细胞的扩增倍数为131.23±18.26，明显高于A组（28.84±2.28）、B组（100.18±10.73）、C组（74.13±11.25），具有显著性差异(P<0.05)。在培养的第15天各组CD41+巨核细胞所占比例均较第10天明显下降( P<0.05)，CD41+细胞的扩增倍数较第10天均显著下降(P<0.01)（附表）。Table. Percentage of CD41+ cells in mobilized peri-pheral blood in groups with different combinations of cytokines added (略）
CFU-MK观察
取第5、10天的悬浮细胞分别进行CFU-MK培养，第3天开始出现巨核系集落形成，第14天集落明显形成（附图）。各组在不同时间均有集落生成，其中培养第5天的细胞形成的集落中，D组产生的CFU-MK数为83.33±10.02，明显高于其他3组（P<0.05），培养第10天的细胞形成的集落中，D组产生的CFU-MK数最高为120.67±13.01，明显高于A组（53.67±7.77）、B组（92.00±6.56）、C组（82.00±8.19），差异具有显著性（P<0.05）。以上结果显示，经体外诱导扩增第5、10天的巨核祖细胞仍具有增殖能力。
讨 论
巨核祖细胞增殖分化过程受多种造血生长因子和细胞因子的调控。TPO是公认的调节巨核细胞（MK）产生和血小板生成的最重要细胞因子，作用于巨核系发育的各个时期，促进巨核细胞增殖、分化、成熟和血小板的生成［2，3］。TPO是诱导扩增巨核系的首选细胞因子，它对某些细胞因子有协同作用，能加强诱导巨核系祖细胞增殖、分化的效能。FL是近年来发现的作用于造血干祖细胞的细胞因子，单用无明显作用，但可与TPO一起发挥协同作用，刺激巨核细胞系祖细胞的扩增［4］，与GM-CSF、IL-3联合能够刺激巨核系集落的生长，并且在体外长期维持MK生成［5］。
本研究实验的4种组合均能在体外诱导扩增巨核细胞的生成，TPO在其中起到了关键性的调控作用，其他因子具有协同作用。第10天D组（TPO/FL/IL-6/IL-3）与C组(TPO/SCF/IL-6/IL-3) CD41+细胞扩增倍数比较差异具有显著性（P<0.05），提示了FL比SCF在巨核系的诱导扩增中能发挥更好的协同扩增作用。
经过大量实验研究，人们已用多种因子组合达到了巨核祖细胞的有效扩增。目前主要选用简单、高效、经济、适用于临床的最佳因子组合［6］。本研究发现，TPO/FL/IL-6/IL-3因子组合中，CD41+细胞及CFU-MK扩增的能力均明显高于A、B、C 3组（P<0.05），该因子组合为体外扩增巨核祖细胞的最佳细胞因子组合。
在本研究中，第5天CD41+细胞所占比例较第0天明显增多（P<0.01），CD41+细胞数也较前明显增多；第10天CD41+细胞所占比例虽较第5天下降，但随着体系总细胞的扩增，CD41+细胞的绝对数仍是较前增加的。第15天CD41+细胞所占比例比第10天明显减少，CD41+细胞数也随之明显减少，显示了CD41+细胞数在第10天达到增殖高峰，第15天迅速下降。这一结果提示，体外培养第10天为动员外周血来源的巨核祖细胞体外扩增的最佳时间。
总之，通过合理的细胞因子组合、适宜的培养条件，可以实现外周血来源的巨核祖细胞体外最大程度的定向扩增。但扩增后产物最终要应用于临床，一些临床前和临床实验已显示了体外扩增的MK能够安全地输给患者，病人耐受性好，没有严重的毒副作用和细菌污染，并且输入的MK在体内能够继续增殖［7，8］。我们设想，通过输注体外扩增的巨核祖细胞可能代替血小板的输注，取得更好的临床效果。
致谢：本研究工作得到香港中文大学附属威尔斯亲王医院儿科杨默研究员、广州南方医科大学南方医院血液科孟凡义教授和麒麟鲲鹏（中国）生物药业有限公司等的支持，特此致谢。
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有核细胞计数篇7
[关键词] 血小板参数；血小板增多症；骨髓增殖性肿瘤；反应性血小板增多症
[中图分类号] R558+.3[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721（2012）04（c）-0071-02
血小板增多症是指外周血中血小板计数（BPC）≥450×109/L，临床上根据病因不同将其分为两种：骨髓增殖性肿瘤（MPN）和反应性血小板增多症（RT）。MPN主要包括慢性粒细胞白血病（CML）、真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）和慢性特发性骨髓纤维化（IMF），其各亚型之间可共同存在和相互转化，部分可转化成急性白血病[1]，而RT在原发疾病得到有效治疗或诱发因素消失后可得以缓解，并不出现造血干细胞异常，二者的治疗方法完全不同，因此需进行鉴别诊断。笔者回顾性分析了143例血小板增多症患者的血小板四项参数（PLT、MPV、PDW、PCT）和骨髓巨核细胞计数及分类，探讨其在MPN和RT鉴别诊断中的意义，现报道如下：
1 资料与方法
1.1 一般资料
威海市立医院2007年12月～2011年5月收治血小板增多症患者143例，其中骨髓增殖性肿瘤（MPN）46例，行骨穿的患者有46例；反应性血小板增多症（RT）97例，行骨穿的患者有37例，全部患者符合中华血液学会及全国血栓与止血学术会议制定的诊断标准。
1.2 方法
用Sysmex公司XE-2100血液分析仪及配套试剂阻抗法测定血小板（PLT）计数、平均血小板体积（MPV）、血小板分布宽度（PDW）、血小板压积（PCT）；常规方法制作骨髓涂片，瑞吉染色，镜检计数并分类2.0 cm×1.5 cm区域髓片的巨核细胞。
1.3 统计学方法
应用SPSS 13.0软件进行数据整理和分析，数据以x±s表示，采用t检验，P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
两组患者血小板参数水平见表1，两组患者骨髓巨核细胞数见表2。由表1、2可见，MPN组患者血小板参数BPC、PDW和PCT较RT组患者显著增高，MPV显著降低，（P均< 0.05）；MPN组患者骨髓巨核细胞数、原始及幼稚巨核细胞数较RT组患者显著增高（P均< 0.05）。
3 讨论
骨髓增殖性肿瘤是粒系、红系和巨核系异常增生的克隆性造血干细胞疾病，表现为骨髓一系或多系细胞增殖，多不伴异常发育的向终末分化成熟，因而外周血表现一种或多种血细胞质和量的异常，且MPN各亚型几乎都有白细胞、血小板及巨核细胞增多，后期伴随骨髓纤维化和骨髓衰竭。2005年Baxter等报道了MPN患者存在高致病性的获得性基因突变，使细胞对促红细胞生成素（EPO）、促血小板生成素（TPO）等细胞因子高度敏感，细胞的增殖活性明显增强，导致MPN的发生[2]。
RT病因复杂，其发病机制尚未被完全阐明，但白细胞介素6（IL-6）有重要作用，有研究表明，IL-6及其他细胞因子可升高促血小板生成素，IL-6也可以刺激巨核细胞增生。RT常见于多种疾病，如感染、炎症、肿瘤、贫血、手术（尤其脾切除后）等，某些药物亦可引起血小板增多。血小板参数（BPC、MPV、PDW 、PCT）与肿瘤、心脑血管疾病、烧伤、类风湿性关节炎及急性白血病的研究也较多[3-4]。反应性血小板增多常为暂时性，一般不引起症状，血小板功能一般正常，出血和血栓形成很少见，但过量血小板本身可能干扰止血功能而引起出血，有时自发聚集而形成血栓。
血小板来源于成熟的巨核细胞的胞浆，血小板具有维持血管内皮完整性的功能和黏附、聚集、释放、促凝和血块收缩功能，故BPC可反映骨髓增生状态、血小板更新速度和细胞动力学变化，对临床具有一定的意义。MPV是反映巨核细胞增生和血小板生成的参数，与血小板功能密切相关，多用于鉴别血小板减低原因，评估骨髓造血功能恢复情况，MPV与BPC呈非线性负相关，随BPC的增高，MPV减小[5]。初生成的血小板体积较大，含有较多致密颗粒，可释放更多的5-羟色胺等生物活性物质，其聚集和黏附功能较强，有很强的止血和凝血功能，导致发生血栓性疾病的概率较大。PDW是反映血小板分布宽度的差异参数，PDW增高反映血小板均一性差，一般认为MPV增大时对PDW也有影响，两者呈正相关，PDW联合大血小板比率（P-LCR）是诊断免疫性血小板减少症（ITP）的可靠指标。PCT值是计算值，受血小板数量及大小的影响，PCT值的变化一般与血小板数量变化一致[6-7]。本研究发现MPN患者BPC、PDW及PCT均较RT患者显著增高（P < 0.05），而MPV显著降低（P < 0.05）。
MPN时造血干细胞异常导致巨核细胞及血小板异常增生，异常克隆促进克隆向巨核血小板分化的调节因子优先反应[8]。本研究发现MPN患者骨髓巨核细胞数较RT患者显著增高；MPN患者巨核细胞中原始及幼稚巨核细胞数比RT患者显著增高；MPN患者外周血BPC较RT组显著增高，（P均< 0.05），MPN患者骨髓可见小巨核细胞60.87%（28/46），RT患者骨髓片未见小巨核细胞。
因此，骨髓巨核细胞计数及分类、血小板参数BPC、MPV、PDW和PCT 可应用于血小板增多症的鉴别诊断。
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有核细胞计数篇8
【摘要】 ［目的］探讨不同方法培养下的大鼠破骨细胞(osteoclast，OC)骨吸收功能的差异，以及骨吸收关键基因ATPase a3的mRNA表达水平的差异，为体外实验奠定基础。［方法］机械分离和诱导培养，即从新生24h的大鼠长干骨骨髓腔内壁机械分离成熟OC和1，25(OH)2 D3诱导大鼠骨髓细胞形成破骨样细胞(osteoclast like cell，OLC)，对获得的OC进行形态和骨吸收功能观察，并测定OC骨吸收关键基因ATPase a3的mRNA表达水平的差异。［结果］OC和OLC均为抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色阳性的多核巨细胞，与细胞共培养骨片上可形成骨吸收陷窝；诱导法培养出的OLC数目多于机械分离法，但诱导早期陷窝较之小而浅，诱导后期基本接近OC；OC骨吸收关键基因ATPase a3的mRNA，在机械分离8h与诱导培养6天的细胞表达量无显著差异，但都远少于培养8天的表达量。［结论］诱导法可以培育出大量的OLC，优于机械分离法，但早期骨吸收功能较弱，OC骨吸收功能与其核数相关。后期的OCL与机械分离OC接近，可以用于各类实验。
【关键词】 破骨细胞 破骨样细胞 骨吸收 ATPase a3
破骨细胞（osteoclast，OC）是骨吸收的执行细胞，OC骨吸收机制研究对阐明骨组织生理病理机制和代谢性骨病的防治具有十分重要的意义，然而OC为高代谢的分化终末细胞，组织含量极少又非常脆弱，自 Chambers首次建立OC体外培养的方法以来，各国学者不断完善，李氏等在国内首次建立了骨髓细胞诱导培养法，建立了破骨样细胞(osteoclast like cell，OLC)培养体系，发现OLC和OC是同一种细胞［12］。OC的骨吸收功能以及形成的数目，是其活性的集中体现，同时，ATPase a3基因是骨吸收功能执行的关键基因，该基因的缺乏或突变，是骨吸收障碍发生骨硬化症和胚胎致死的关键原因［3］。本实验在经典的机械分离法和骨髓细胞诱导培养法的基础上加以改进，对其形态、分化及功能进行了动态观察，测定OC骨吸收关键基因ATPase a3的mRNA表达水平量，探讨不同方法培养下的OC骨吸收功能的差异。
1 材料
1.1 动物 新生24h内SD大鼠乳鼠，4周龄SD雄性大鼠（SPF级），由浙江中医药大学实验动物中心提供［SCXK（沪）20030003］。
1.2 主要试剂 M199培养基、αMEM培养基、HEPES液（美国Gibco公司），1，25(OH)2D3、萘酚ASBI磷酸盐（美国Sigma 公司），甲苯胺蓝（瑞士Fluka公司）、胎牛血清(杭州四季青公司)，Trizol、引物合成（美国Invitrogen公司），MMLV 逆转录酶（美国promege公司）。
1.3 盖玻片及骨磨片的制备 将10×10mm盖玻片，经硫酸-重铬酸钾清洗液中过夜，蒸馏水超声波清洗，自然晾干，高压消毒后备用。取新鲜成年牛股骨皮质骨，锯成厚骨片，经角磨机和细金刚砂纸磨至约15μm厚，再剪成5×5mm大小，三蒸水中超声波清洗后，自然晾干，使用前紫外线双面照射各4 h。
2 方法
2.1 大鼠OC机械分离法培养 参考文献［4］方法操作，培养1h后再用培养液冲洗，分别于4、8和10h取出盖玻片进行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色，8h时抽提OC总RNA，并将与OC共培养24h的骨片甲苯胺蓝染色。
2.2 大鼠骨髓细胞诱导法 选用4周龄SD雄性大鼠，断颈处死，无菌条件下分离完整股骨、胫骨，暴露髓腔后用αMEM培养基（含20%胎牛血清）冲洗骨髓腔数次至骨干发白为止。冲洗液200目筛网过滤后，收集液接种于25ml培养瓶，标准培养(饱和湿度、5% CO2、37℃) 1h后收集上层细胞液(含骨髓单核细胞)，500 r/min，4℃离心5 min，弃上清，用完全培养基(含20%胎牛血清、1×10-8mol/L的1，25(OH)2D3、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml的αMEM培养基)稀释细胞至1.5×106个/孔，将细胞悬液加入预置盖玻片或牛骨片的进口24孔细胞培养板。常规培养，每3 d换液1次，每次换总量的一半。培养全过程中，动态观察细胞的形态和生长状态，分别于3，6，8，11，14d取出盖玻片进行TRAP染色，抽提6d和8d的OLC总RNA，并将8d、12d与OLC共培养骨片甲苯胺蓝染色。
2.3 OC的形态观察 分别对不同方法培养的细胞进行观察，TRAP染色。将待定培养时间的细胞爬片取出，按照文献［4］方法与步骤进行染色，甘油明胶封片，光镜观察。其中诱导培养法中的OLC含2个胞核以上且呈TRAP染色阳性的细胞即为OC。在200倍光镜下进行OC计数，每个玻片上随机选择10个视野，计数阳性细胞均值并做统计。
2.4 骨吸收功能观察 分别取与上述细胞共培养的骨片，经2.5%戊二醛溶液固定、0.25mol.L-1氢氧化铵中超声波清洗，系列酒精脱水，自然晾干，1%甲苯胺蓝染色，观察骨片上骨陷窝形态并拍照，利用计算机图像分析系统计算整张骨片上骨吸收陷窝面积之和，结果以陷窝面积/片（mm2/片）表示。通过骨片上吸收陷窝的面积变化情况，进一步鉴定两种OC体外培养体系差异。并将观察后的骨片用2.5%戊二醛和1%四氧化锇各固定，酸性二钾氧基丙烷梯度脱水，丙酮清洗，CO2临界点干燥，镀金，制备电子显微镜标本。
2.5 RTPCR半定量分析 Trizol法提取细胞总RNA，取1μg 总RNA采用两步法RTPCR。ATPase a3基因［5］与内参甘油醛3磷酸脱氢酶（glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase， GAPDH)引物（见表1）。PCR反应条件为：94℃ 30sec，61℃（GAPDH 60℃）30sec，72℃ 1min。取扩增产物各10μl在1.7％琼脂糖凝胶电泳，用Imagepro plus 6.0软件对扩增产物进行密度值分析，分别计为DATPase a3、DGAPDH，DATPase a3 / DGAPDH表示ATP a3 mRNA的相对含量。
2.6 统计学分析
采用SPSS13.0统计软件包进行统计。各组数据采用x±s表示，计量资料比较用单因素方差分析（oneway ANOVA）。以P
3 结果
3.1 OC形态观察 新生大鼠机械分离的细胞数量较多，均匀平铺。培养1h后，大部分未贴壁细胞被M199冲走，此时可见到玻片上多核OC。4h后细胞形态清晰，表面有微绒毛，呈伪足样运动，细胞外形不断变化，部分细胞之间纤维样突出连接（图1），随着培养时间的延长，细胞充分伸展，体积变大，核仁清晰可见。但培养24h后，大部分OC细胞壁增厚，核固缩，微绒毛消失。含1，25(OH)2D3诱导剂的大鼠骨髓细胞悬液接种于培养板后，4h见细胞均匀分布于培养板底部，呈短梭形贴壁生长。诱导培养6d时，可见体积较大、多核（3～10个）的OLC，呈圆形、多角型等多种形态，时有细胞突起向外延展，胞质密度较低，细胞核或集聚在细胞中央，或散在细胞周边，核内可见1～2个核仁不等（图2），周围的单核细胞不断融合在较大的OCL中，细胞核逐渐增多，与机械分离培养4h的OC相似。随着培养时间的延长，OLC数量递增，8d时达峰值，后期细胞开始空泡变性，细胞裂解碎片增加，细胞核呈现固缩、碎裂，细胞膜破裂，细胞死亡。
3.2 TRAP 染色 TRAP染色是鉴定OC的特异性酶学染色方法，TRAP染色阳性（TRAP+）为：细胞质染成红色或酒红色，细胞核不着色。机械分离的细胞培养4h后可见到典型的TRAP+的OC，培养8h、10h与4h相比较TRAP+的OC数量没有显著差别（P>0.05）（见表2），但到10h时OC细胞萎缩，空泡变性明显（图3）。诱导培养第6d开始，可见多核TRAP+细胞，之后TRAP+的细胞逐渐增多，出现较大型的多核细胞，并在第8d数量达到高峰（图4），与其它时间组差异明显（P
图1 机械分离培养 4h，表面有微绒毛（小箭头），细胞之间纤维样突出连接（大箭头）。(倒置显微镜×200) （略）
图2 诱导培养第6天，单核细胞之间，出现体积较大、多核OLC（箭头）。(倒置显微镜×400）（略）
图3 机械分离培养 10h，TRAP染色阳性，OC空泡变性（小箭头）。(TRAP染色×200) （略）
图4 诱导培养第8天，TRAP染色阳性的多核细胞（燕尾箭头），单核细胞核增多，体积增大（三角箭头），TRAP+的单核细胞（白色箭头）。(TRAP染色×200）（略）
表1 各基因引物序列及片段大小（略）
表2 机械分离法不同时间TRAP+ 细胞个数（略）
不同培养天数之间比较P>0.05
表3 不同诱导天数TRAP+ 细胞个数（略）
不同培养天数之间比较，P>0.05，P
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3.3 骨吸收功能观察 骨片上吸收陷窝是OC骨吸收的直接结果，其陷窝数量、大小和深度直接反应OC骨吸收的能力。机械法培养24h的骨片甲苯胺蓝染色后，在光镜下可见吸收陷窝呈蓝紫色圆形、椭圆形、腊肠形等多种形态(图5)，边界清楚，部分出现穿凿样改变。而诱导培养8d时，在骨片上发现少量呈蓝紫色小陷窝，随着诱导时间的延长，陷窝的数量、深度均增加，12d时可见大量的吸收陷窝(图6)。经扫描电镜观察可清楚识别骨吸收陷窝，成熟的OC骨吸收陷窝较OLC深，底面粗糙，可见有纤维样基底(图7)，但是相同面积大小的骨片上，诱导12d的骨陷窝数量明显多于机械法。机械法培养24h的骨吸收陷窝比诱导培养8d形成的骨陷窝面积略多，但远少于诱导12d形成的骨吸收陷窝面积。同时机械法产生的吸收陷窝的个数多于诱导8d，远少于诱导12d的数量。（见表4）
表4 不同培养条件骨陷窝的个数(个)和陷窝面积（略）
不同培养时间之间比较P
3.4 两种方法ATPase a3的表达变化 ATPase a3基因经RTPCR扩增，1.7％琼脂糖凝胶电泳（图8），发现机械分离8h目的基因扩增产物密度值少于诱导培养8d，差异明显（P0.05），而且相对密度值同样少于诱导培养8d。（见表5）
图5 机械分离培养24h，与OC共培养的骨片，出现较周围骨组织深染的骨陷窝，腊肠形骨质吸收区（箭头）。(甲苯胺蓝染色×150)（略）
图6 诱导培养12d，与OLC共培养的骨片，出现大量骨陷窝，斑片状骨质吸收区（箭头）。(甲苯胺蓝染色×150)（略）
图7 机械分离培养24h，与OC共培养的骨片，骨吸收陷窝较深呈现呈不规则形，边界清晰、底面粗糙不平(箭头)。(扫描电镜×150)（略）
图8 RTPCR产物，ATPase a3基因mRNA表达量，诱导法8d较其它时间段多。（略）
表5 不同时间段RTPCR产物密度值（略）
不同组间比较，P>0.05，P
4 讨论
OC是高度分化的多核巨细胞，直接参与骨吸收，是骨组织吸收的主要功能细胞。目前，多数学者认为OC来源于单核/巨噬细胞前体细胞［67］，到目前为止尚缺乏成熟的OC细胞株，因此机械分离法是最直接最有效获得成熟OC的方法。根据OC体形巨大、能迅速粘附于基质的特点，本研究在原机械分离方法上改进，培养1h后再用培养液冲洗，以除去大量未贴壁的细胞，达到相对纯化的目的。24h动态观察发现，8～10h最典型，胞核清晰，细胞饱满，丝状足密集，呈伪足样运动、TRAP阳性等特点，12h细胞开始凋亡，24h典型细胞形态完全消失，机械分离法培养的OC含量少又非常脆弱，成为其生化学和分子生物学研究的严重限制因素。
由骨髓和其它组织诱导培养形成的细胞与成熟的OC来源不同，称为OLC［2］。课题组用1，25(OH)2 D3成功地在体外诱导SD大鼠骨髓细胞分化形成OLC，发现在1×10-8mol.L-1 1，25(OH)2 D3的作用下，骨髓细胞可形成大量的TRAP+、在骨片上形成陷窝的多核巨细胞，与文献报道一致［1］。1，25(OH)2D3为VitD生物活性最强的代谢产物，与成骨细胞（osteoblast， OB）的1，25(OH)2D3受体结合，上调破骨细胞分化因子（receptor activator of NFκB Ligand， RANKL），直接刺激多核OC的分化成熟，同时可促使OB分泌粒细胞集落刺激因子（MCSF），间接促进OC形成［8］。骨髓中的破骨前体细胞在诱导因子的作用下逐渐向OC分化，实验显示OCL骨吸收数目、面积逐渐增多，活力逐渐增强。1，25(OH)2 D3诱导出的OLC数量明显多于机械分离的方法，且OCL周围的单核细胞逐渐不断融合，形成更大的OCL，细胞核逐渐增多，早期细胞核多于5个的OLC数量总体上少于机械分离OC的数量，但晚期多核OCL明显增多，且存活时间远长于机械分离的成熟OC。机械法骨吸收陷窝边界清楚，部分出现穿凿样改变，而诱导法从出现少量小陷窝到陷窝的数量、深度逐渐增加。虽然诱导培养OLC依赖骨髓细胞中的OB和OC前体细胞来实现的，很难分离到纯的OC，还有待于进一步改善方法提高其纯度，但是诱导法培养法明显优于机械分离法。
Atpase a3基因产物为分子量116 KDa的蛋白(a3)，是OC空泡型质子泵(空泡型氢离子三磷酸腺苷转运酶Vacuolar H+translocatiing，ATPase，简称VATPase) 跨膜部分之一，VATPase活化后将H+分泌到细胞外而完成骨吸收功能。李亦平等［9］克隆了小鼠该基因，并制备出该基因缺失的小鼠，该小鼠的OC数目正常，可附着在骨上，但不能形成吸收陷窝；破骨样多核细胞不能形成细胞外酸化腔，也不能使骨去矿物化；OC失去细胞外酸化功能，使小鼠出现严重的骨质硬化。同时Niikura［3］也表明ATPase a3对OC发挥骨吸收功能是必需的，该基因的突变是婴儿恶性骨硬化病发生及胚胎致死的关键原因［10］。利用OC噬骨形成吸收陷窝特性，观察陷窝的形态和测量陷窝的数量、大小、深度，以及Atpase a3基因表达量是检测OC骨吸收功能的可靠指标。
RTPCR实验证实，经机械分离培养后，相对数量少的成熟的OC骨吸收关键基因ATPase a3表达量较诱导早期（6d）OLC多，而少于8d的OLC，由此可知细胞核数与OC骨吸收功能直接相关，与Manolson［11］报道一致，其研究发现a3亚基的表达随破骨细胞核数(2～5，6～9和≥10)的增多而逐渐增加，a3 mRNA在大破骨细胞中比在小破骨细胞中高2.5倍，而a3是VATPase的关键性亚基，由ATPase a3基因调控，是功能性破骨细胞的必需成分，可见诱导培养的早期OLC可能并未达到完全分化且胞核数少，因而在骨片上形成的吸收陷窝较小，后期多核OCL逐渐增多，陷窝的数量、深度逐渐增加，基本接近成熟的OC。由此可知：机械分离培养法，可简单有效的获得骨吸收功能较活跃的OC，但存活时间短不利于进行长期生化和分子生物研究，且需要牺牲大量的动物；而1，25(OH)2D3诱导法可以获得数量多且生存时间较长的OCL，因此更适合用于OC分化发育过程的研究以及关键基因的转基因筛选应用。同时OC的骨吸收功能与其核数直接相关，机械分离下来的细胞为胞核多的成熟OC，骨吸收功能强于胞核较少的早期OLC，单核细胞逐渐不断融合，形成更多、更大的OCL，诱导晚期的OCL数量和功能上完全可以替代成熟OC进行各类实验。
OC功能异常导致骨改建平衡失调，是多种代谢性骨病的病理基础，1，25(OH)2D3诱导法成功的建立OCL培养体系，替代机械分离成熟OC方法，建立较为稳定的实验平台，为利用分子生物方法高效特异的抑制OC的骨吸收功能奠定基础，能有效的纠正绝对或者相对旺盛的骨吸收功能状态，达到恢复骨吸收、重建动态平衡，就可以有效防治如骨质疏松症、Paget’s病、激素性股骨头坏死、风湿性关节炎、肿瘤、牙周病等疾病，因此具有广阔的基础研究和临床应用前景。
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