纳米粒子范文

纳米粒子篇1

摘要:磁性纳米粒子因兼具磁学特性和纳米材料独特性能，被广泛应用于各个领域。就磁性纳米粒子的种类、特性、制备和表面修饰四个方面展开介绍，综述了脂肪酶、漆酶、淀粉酶及其复合酶等生物酶固定化酶技术的最新研究动态，针对磁性纳米粒子在固定化酶技术的研究应用现状进行了总结，以期为磁性纳米粒子固定化酶技术的应用研究提供参考。

关键词:磁性纳米粒子;脂肪酶;漆酶;淀粉酶;固定化

酶酶是具有生物催化功能的高分子物质，具有高效性、专一性、反应条件温和、无污染等特点［1］，在食品加工、药学和医学等研究领域中有着巨大的应用潜力。然而，大多数酶是蛋白质，其活性易受温度、pH等因素影响，且与底物产物的混合物不利于其回收，难以实现产物的分离纯化和连续化生产［2］。20世纪60年代迅速发展起来的固定化酶技术很好的解决了这些问题，有效提高了酶的利用率，并实现了产业化发展。其中，酶的固定载体和技术研究一直是酶固定化研究的核心问题，重点是寻找新的载体，确保固定后的酶保持其催化活性、催化特性和稳定性，同时，可实现高负载量和复合酶链式反应［3］。近几年，新型载体和技术有:交联酶聚集体［4］、“点击”化学技术［5］、多孔支持物［6］和以纳米粒子为基础的酶的固定化［7］等。纳米粒子作为酶固定化的新型载体，具有良好的生物相容性、比表面积大、颗粒直径小、较小的扩散限制、较高的载酶量及在溶液中稳定存在等优点［8］。粒子尺寸在1～1000nm范围内的球状或囊状结构的粒子常被用于酶的固定化，用于酶固定化的纳米载体材料可分为磁性纳米载体和非磁性纳米载体等［9］。本文综述了磁性纳米粒子的特性、制备方法及其在固定化酶技术研究领域的应用现状，以期为促进磁性纳米粒子固定化酶技术的应用研究提供参考。

1磁性纳米粒子

纳米材料［10，11］的粒径尺寸为纳米级，通常介于1～100nm之间。磁性纳米粒子［12，13］作为当今最受关注的一类纳米材料，其多功能磁性复合微球常被用于药物释放、生物大分子靶向分离等生物医学和分离工程相关领域的研究。

1．1磁性纳米粒子的特性

磁性纳米粒子不仅具备表面效应、小尺寸效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应［14，15］4个基本普通纳米粒子效应，同时还具有特殊的磁学性质:超顺磁性、高矫顽力、低居里温度与高磁化率等［16～19］。1．1．1超顺磁性超顺磁性是指磁性纳米颗粒尺寸小于临界尺寸时具有单畴结构，在较高温度下表现为顺磁性特点，但在外磁场作用下其顺磁性磁化率比一般顺磁材料大好几十倍，称为超顺磁性。超顺磁性即在有外加磁场时，材料表现为有磁性，当无外加磁场时，材料无磁性。故超顺磁性的纳米颗粒具有较好的分散性。

1．1．2高矫顽力

强磁物质(如:铁磁体)一般在外加磁场减小为零时，其磁化强度不为零，剩余的磁化强度称为剩磁。矫顽力是指使剩磁减至为零而添加的反向磁场。矫顽力与成分、晶体点阵和取向等因素无关，其主要影响因素为点阵缺陷，即偏离理想晶体结构的程度。

1．1．3低居里温度

带磁的磁性体会在某一温度因热失去磁性，这一温度称为居里温度。居里温度是物质磁性的重要参数，通常正比于交换积分，与间距和原子构型有关。纳米微粒的磁性常因小尺寸效应和表面效应发生变化，故其居里温度通常较低。

1．1．4高磁化率

磁化强度M与磁场强度H之比称为磁化率，常用cm表示，即M=cmH。当cm＞0，为顺磁质，当cm＜0，为抗磁质，其值一般都很小。

1．2磁性纳米粒子种类

磁性纳米粒子一般分为天然磁性纳米粒子和人工合成磁性纳米粒子。人工合成磁性纳米粒子主要有:Fe、Co、Ni等［20］金属纳米粒子;Co3O4、Mn3O4等金属氧化物和各种铁氧化体纳米粒子等［21，22］。铁的氧化物能定期排出体外，对人体健康危害较小，具有良好的生理安全性，因此Fe3O4磁性纳米粒子多被用于生物医药领域［23］。

1．3磁性纳米粒子制备

1．3．1共沉淀法

共沉淀法［24］即向铁盐和亚铁盐混合液中，添加合适的沉淀剂，经加热发生共沉淀，制得超微粒的方法。共沉淀法制备得到的粒子尺寸较小，然而，制备过程中因水解平衡反应复杂，粒子的成核过程和生长过程会受到影响，因此得到的粒子有较宽的尺寸分布。总的来讲，该方法有较低的反应温度、简单的设备要求，且反应过程简单易控制，是制备磁性纳米粒子的主要方法。

1．3．2高温分解法

高温分解法［25］是以高沸点有机物为溶剂，有机金属化合物为原料，经加热分解来制得纳米粒子的方法。利用高温分解法制备的磁性纳米粒子表面光滑，结晶度高，粒径小且粒径可控，粒径分布均匀。但此方法反应条件(高温高压)苛刻，设备要求高，反应体系为有机相，且经过表面处理后的合成粒子才能被转移到水相中。

1．3．3沉淀氧化法

沉淀氧化法即二价铁盐在氧化剂作用下，发生部分氧化制备磁性纳米粒子的一种方法，常见的是以空气作为氧化剂氧化Fe(OH)2，李乾峰等［26］用NaNO3、NaClO3、KMnO4替代传统的空气作为氧化剂氧化Fe(OH)2制备Fe3O4磁性纳米粒子，研究了氧化剂、反应温度、反应液pH等工艺条件对制备的Fe3O4磁性纳米粒子粒径及磁饱和强度的影响，结果表明:Fe3O4磁性粒子粒径主要受氧化剂氧化能力和反应液pH的影响。与空气氧化制备的Fe3O4磁性粒子比较，采用NaNO3和NaClO3为氧化剂制备的Fe3O4磁性粒子均为球形，粒子形态与pH无关，且粒径大小相近时，有较高的比饱和磁化强度。

1．3．4溶胶凝胶法

溶胶凝胶法［27，28］是制备金属氢氧化物及金属氧化物超微粒的方法。被用于溶胶凝胶法中作为前驱物的化合物要具备易蒸馏、重结晶技术纯化、可溶于普通有机溶剂、易水解等特性，金属醇盐作为前驱物被广泛用于溶胶凝胶法制备纳米氧化物材料。该方法具有反应物丰富、颗粒粒径均一、高纯度、粒径小、过程易控制等优点。

1．4磁性纳米粒子表面修饰

磁性纳米粒子不仅具有纳米粒子特性，同时还具有特殊的磁学性能，近年来被广泛应用于生物分析等领域。但是，磁性纳米粒子粒径小、比表面积大、表面能高，为不稳定体系，易发生团聚，所以，需要对磁性纳米粒子表面进行功能化，降低其表面能，改善磁性纳米粒子的分散性及稳定性，同时使磁性纳米粒子的磁响应强度、表面活性和生物相容性等特性得到改善和提高。

1．4．1有机小分子修饰

①表面活性剂。表面活性剂含有长链基团，可以形成空间位阻，一方面可控制粒子的形态和尺寸，另外，可改善粒子的表面性能，从而起到稳定磁性纳米粒子的作用。油酸常被用来修饰Fe3O4，靳艳艳等［29］通过高温热解法得到油酸稳定的磁性纳米粒子，以高碘酸钠为氧化剂，氧化其表面的油酸，制备得到单分散羧基化Fe3O4磁性纳米粒子，其粒径为12nm，且粒径均一，在水中有良好的分散性，XRD和VSM表征结果显示，磁性纳米粒子的磁强度和成分在氧化制备羧基过程中基本不受影响。张晓闻等［30］采用改进的溶剂热法，以柠檬酸钠为稳定剂，制备出羧基功能化的Fe3O4磁性粒子，该粒子具有超顺磁性和高饱和磁化强度，磁响应性良好，可应用于磁性粒子偶联或复合。

②硅烷化偶联剂。硅烷化偶联剂既有与磁性纳米粒子结合的Si－OH，又含有－NH2、－COOH、－SH、－CHO等能与生物分子结合的官能团。常被用于磁性纳米粒子表面修饰的硅烷化偶联剂有3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和3-巯丙基三乙氧基硅烷(MPTES)。付玉丽等［31］采用化学共沉淀法合成Fe3O4磁性粒子，通过APTES化学包裹得到有机硅表面修饰的Fe3O4磁性粒子，APTES-MNPs呈球形，粒径约17nm，APTES-MNPs对刚果红染料的吸附符合Langmuir等温吸附模型，该粒子吸附性能好、易回收。

1．4．2有机高分子修饰

①天然生物大分子。目前，多糖类聚合物和氨基酸类聚合物是用于修饰Fe3O4磁性纳米粒子主要的天然生物大分子，利用天然生物大分子修饰的磁性纳米粒子其生物相容性得到大大的改善，且赋予复合材料新的生物活性。李璇等［32］以乙酰丙酮铁为铁源，聚乙二醇为溶剂，采用高温热解法制备聚乙二醇修饰的超顺磁性氧化铁磁性粒子PEG-SPIONs，后将糖酐Dex水溶液与PEG-SPIONs混合摇床培养得到Dex修饰的Dex/PEG-SPIONs复合粒子，该复合粒子为单晶体结构且分散性较好，具有超顺磁性，同时，Dex作为一种临时的血浆替代品具有很好的生物安全性，故Dex/PEG-SPIONs在生物医学等方面具有极好的应用前景。吴志超等［33］采用高锰酸钾为氧化剂氧化油酸包被的Fe3O4磁性粒子，制得表面包被有壬二酸的新型羧基磁性纳米粒子，该粒子表面羧基含量高且在水中具有良好的分散性，其水解后带负电荷，可与蛋白质表面带正电荷的氨基发生静电相互作用，这一新型的羧基功能化的超顺磁性纳米粒子吸附牛血清蛋白对固定化细胞、蛋白药物靶向载体和固定化酶载体的研究具有重要的指导意义。

②合成高分子。利用不同的化学方法可合成不同需要的高分子修饰物用来修饰磁性粒子。邓啸［34］选用聚多巴胺修饰磁性纳米粒子，首先采用碱共沉淀法合成MNPs，多巴胺单体可在类似海水的碱性(pH8．5)条件下发生自聚合作用，因此，通过调控pH可在MNPs表面形成一层聚多巴胺层，获得聚多巴胺修饰的磁性四氧化三铁纳米粒子(PD-MNPs)，该功能化磁性微球可有效的固定黑曲霉脂肪酶，固定化脂肪酶催化活性及稳定性较游离酶均有明显提高。

1．4．3无机材料

用于Fe3O4磁性纳米粒子表面修饰的无机材料主要是SiO2，制备SiO2修饰的磁性纳米粒子的方法主要有:溶胶凝胶法、气溶胶高温分解法和反相微乳法。张慧勇［35］采用溶胶凝胶法制备Fe3O4/SiO2核壳结构复合纳米粒子，并对不同Fe3O4制备方法(共沉淀法、还原沉淀法和水热法)对应的Fe3O4/SiO2复合纳米粒子进行性能比较。其步骤如下:首先采用柠檬酸钠对纳米粒子进行表面修饰，然后在醇和水的混合体系中，碱性条件下催化正硅酸乙酯水解，磁性纳米颗粒表面被生成物包裹，制得的二氧化硅磁性复合微球具备小粒径核壳结构。结果表明，利用水热法制备Fe3O4粒子的分散效果最佳，包被效果较好，二氧化硅磁性复合微球在室温下表现出良好的稳定性。马丽等［36］采用溶胶凝胶法制备Fe3O4/SiO2复合纳米粒子，用3-APTES对Fe3O4/SiO2复合粒子进行氨基修饰，并用于漆酶的固定化。固定化酶在热稳定性、重复稳定性、pH稳定性方面均优于游离酶，同时，将固定化漆酶用于去除废水中的2，4-二氯酚，反应12h，去除率最高为68.35%，该固定化酶重复使用12次后，对2，4-二氯酚的去除率可保持在52．85%。

2磁性纳米粒子固定化酶技术的应用

通过共聚合表面修饰可将－NH2、－COOH、－OH、－CHO等多种功能基团赋予磁性纳米粒子表面，实现其功能化，因而具有强的磁响应性能、高比表面活性和良好的生物相容性，磁性纳米粒子已被广泛应用于生物化学领域，如天然产物中生物活性物质的分离，有害化合物的降解等。固定化酶技术［37］，即将游离酶束缚或局限在固定载体内，酶的生物活性及其特有的催化反应保持不变，并可实现回收重复利用的一类技术。固定化酶与游离酶相比有稳定性好、不易失活、可重复使用等优点，磁性纳米粒子作为固定化酶使用的固体材料，较其他固体材料具有独特的优势［38，39］:磁性纳米粒子的超顺磁性及强磁响应性能，可实现酶/底物及产物的快速分离，提高酶的使用效率;将酶固定于磁性纳米粒子可提高其稳定性;而且磁性纳米粒子巨大的比表面积可同时偶联多种生物酶，因此将分离技术和生物酶磁偶联用于多酶固定，可促进多酶链式反应的研究应用。

2．1磁性纳米粒子在脂肪酶抑制剂筛选分离研究中的应用

Zhu等［40］采用共沉淀法制得Fe3O4磁性纳米粒子，硅酸四乙酯(TEOS)、(APTMS)作为硅烷偶联剂，－NH2/MNPs磁性粒子经二甲基甲酰胺(DMF)和10%丁二酸酐作用发生羧基功能化，获得－COOH/MNPs磁性复合粒子，此复合粒子可很好的与脂肪酶共价结合，酶活抑制实验表明，脂肪酶固定化酶(LMNPs)稳定性及活性较游离酶有明显提高。利用脂肪酶复合磁性粒子(LMNPs)成功的从莲叶提取液中分离出quercetin-3-O-β-D-arabinopyranosyl-(12)-β-D-galactopyranoside和quercetin-3-O-β-D-glucuronide两种脂肪酶配体。Sahoo［41］采用溶剂热法，聚乙烯亚胺(PEI)、乙醇胺(EA)、(EDBE)为氨基前体，制得PEI-Fe3O4、EA-Fe3O4、EDBE-Fe3O4氨基化磁性粒子，分别与戊二醛交联剂作用，获得GLU-PEI-Fe3O4、GLU-EA-Fe3O4、GLU-EDBE-Fe3O4，磁性粒子表面的戊二醛与脂肪酶发生相互作用，实现脂肪酶的固定化。其中，EDBE-Fe3O4酶活性最高，是同等游离酶活性的83．9%，此外，EDBE-Fe3O4具有较好的热稳定性、储藏稳定性和重复利用性，其反应动力学参数与游离酶一致。这为脂肪酶的固定化提供了技术支持，同时，实现了脂肪酶抑制剂的快速筛选分离，为研发新的治疗肥胖的药物提供母体化合物。

2．2磁性纳米粒子在α-淀粉酶配体筛选分离研究中的应用

交联酶聚集体(CLEAs)［42］是一种无载体固定化酶技术，是一种将基本纯化的、高浓度的蛋白先沉淀后交联形成不溶性的、稳定的固定化酶技术。较其他酶固定方法，该固定化方法不需要结晶、无需高纯度的酶，该方法可用于大多数酶或蛋白交联酶(蛋白)聚集体的制备，操作简便，应用范围广;获得的固定化酶活性高、稳定性好;无载体、单位体积活性大、空间效率高;Tudorache等［43］将氨基功能化的磁性纳米粒子加入酶溶液，将磁性粒子与酶液混合液进行沉淀、交联，制备了磁交联酶聚集体(MCLEAs)。功能化的磁性粒子可减少酶内赖氨酸残基数，提高酶聚集体的稳定性，同时赋予酶聚集体磁性以进行磁分离，提高酶的使用率。Liu等［44］通过合成α-淀粉酶磁交联酶聚集体从山茱萸果实中提取分离出Querciturone，其α-淀粉酶抑制活性IC50达22．5μg/mL。

2．3磁性纳米粒子在漆酶固定化研究中的应用

漆酶是一种对底物专一性要求较低且氧化还原能力较强的含铜多酚氧化酶，可氧化分解大部分有机污染物，如多环芳烃、多氯联苯、芳氨及其衍生物、染料、色素、炸药等［45］。漆酶主要分布在植物、菌类和微生物中。由于漆酶氧化分解有机物所需条件温和、最终反应产物为水、无污染、来源丰富等优点，在环境保护、造纸业、生物传感器等领域得到广泛研究。然而，游离漆酶稳定性差，且重复利用率低，限制了其在工业中的应用。为克服游离漆酶的缺点，实现漆酶的工业化应用，漆酶固定化技术研究尤为重要，磁性纳米粒子作为近年来酶固定化材料之一，成为漆酶固定化研究的热点。欧阳科等［46］通过化学交联法将漆酶固定在磁性石墨烯载体上，对固定化漆酶的酶学特性及其对双酚A(BPA)的降解功能进行了考察。结果表明，经石墨烯固定后漆酶的耐酸性、耐热性和稳定性有显著提高，漆酶固定后其重复利用性得到改善，重复利用10次后，漆酶活性仍为最初活性的82．01%。固定化酶的米氏常数Km为5．38×10－4mol/L，较游离酶的大，说明固定化酶与底物的亲和力比游离酶小，固定化漆酶对双酚A具有良好的分解能力，水中BPA质量浓度为15mg/L时，经过18h反应，BPA的去除率能达到82．14%左右。Xia等［47］分别制备了氨基化四氧化三铁漆酶固定化酶(Fe3O4-NH2-laccase)和氨基－聚乙烯亚胺四氧化三铁漆酶固定化酶(Fe3O4-NH2-PEI-laccase)，并分别考察了它们的酶学活性和反应动力学参数。结果表明，两种固定化酶较游离酶，酶活性、酶稳定性、酶利用率都明显提高，且对酸的适应能力、热稳定性、储藏稳定性等都有提高;Fe3O4-NH2-PEI-Laccase较Fe3O4-NH2-Laccase有较高的吸附容量和酶活性，Fe3O4-NH2-PEI-Laccase可实现漆酶大量的固定化，更有希望实现漆酶的工业化。

2．4磁性纳米粒子在多酶链式反应中的应用

磁性纳米粒子巨大的比表面积可实现多种生物酶的同时偶联，将分离技术和生物酶磁偶联应用于多酶固定，促进多酶链式反应的研究应用。果汁生产中，颜色、澄清度、口感等是衡量果汁是否合格的重要指标。影响这些指标的因素主要有:细胞壁和细胞质中果胶胶态分散体、淀粉、纤维素和半纤维素等多糖。这些大分子的存在是造成果汁浑浊、口感差的主要原因，而淀粉酶、果胶酶和纤维素酶可以将这些生物大分子分解为小分子，能够有效改善果汁外观和品质。Sojitra等［48］通过共沉淀法合成Fe3O4磁性粒子，以3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)为氨基源对Fe3O4氨基化修饰，以戊二醛为交联剂，将功能化磁性粒子与酶混合液混合孵育，淀粉酶、果胶酶、纤维素酶分别与磁性粒子结合并固定，制得磁性复合酶纳米生物催化剂。该磁性复合酶纳米生物催化剂在热稳定性、pH稳定性、重复利用性等酶学活性及反应动力学参数Km较游离酶都有明显提高。利用该磁性复合酶纳米生物催化剂分别进行葡萄、苹果和梨果汁浑浊实验，混合反应150min后，浑浊度分别降低为46%、41%和53%，结果表明，这一磁性复合酶纳米生物催化剂可替代传统果汁的生产方法应用于果汁的工业化生产中。

3展望

综上所述，磁性纳米粒子固定化酶技术已在生物医药、食品、环境保护等领域被广泛应用，并取得了一些重要成就，但仍存在一些需要解决的问题，主要有以下几个方面:①目前，关于磁性纳米粒子固定化酶研究主要集中在脂肪酶和蛋白酶上，其他酶类研究甚少，且磁性纳米粒子固定化酶方法具有局限性，只适用于一类酶或几种酶的固定化;②功能化磁性粒子固定化酶通常存在固定化酶含量较高、而固定化酶活性较低的问题，解决这一问题，对于提高酶使用率、降低成本、实现工业化大规模操作至关重要;③目前，国内外学者对磁性粒子固定化酶条件优化研究较多，针对磁性粒子与酶作用机制研究较少，磁性粒子固定化酶作用机制有待进一步研究，为磁性粒子的改性和选择提供了重要依据;④以磁性粒子固定化酶为催化剂进行催化反应的反应机制需深入研究，以实现磁性粒子固定化酶技术的广泛应用。总之，磁性纳米粒子固定化酶是一个正在蓬勃发展的研究领域，发展更为高效的方法制备磁性纳米粒子固定化酶仍是有待深入研究和具有挑战性的研究课题。

参考文献

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纳米粒子篇2

1.1空载纳米粒子体外溶血试验在红细胞悬浮液中加入蒸馏水，由于渗透压差异导致红细胞破裂作为阳性对照，在红细胞悬浮液中加入PBS使得红细胞不破裂作为阴性对照组，选取两种高浓度（2mg/mL、1mg/mL）的空载纳米粒子进行了溶血测试。

1.25-FU-PCL-NP的体外释药研究使用分光光度计对5-FU溶液进行200~400nm的全波长扫描，确定了5-FU在水相环境下的最大吸收波长为266.4nm，调整至标准曲线模式，分别选择最大吸收波长作为光源，进行5-FU标准曲线的绘制，通过这条标准曲线，药物释放环境下，分别于0、12、24、36、48、72h测得吸光度值，并根据标准曲线计算释药量，绘制释药曲线。

1.3细胞培养Hccc-9810细胞在含10%胎牛血清的1640培养基中，37℃，5%CO2饱和度下培养。

1.4CCK-8法测定肿瘤细胞增殖抑制实验取处于对数生长期的Hccc-9810细胞，接种于96孔板，调节细胞浓度，使每孔细胞数为8000个，37℃，5%CO2饱和度下培养箱孵育过夜，待细胞贴壁后，分按空白NP组，单纯5-FU组，5-FU-PCL-NP组（按载药率折算5-FU的量），分别按5-FU药物浓度0、5、10、15、20、40、80μg/mL，每个浓度组设立5个复孔，共培养48h，后均用CCK-8法检测各孔存活细胞吸光度。细胞存活率=（处理组OD值-空白对照组OD值）/（对照组OD值–空白对照组OD值）×100%。同时计算半数有效浓度（IC50）值。

1.5流式细胞仪检测细胞凋亡率取处于对数生长期的Hccc-9810细胞，接种于6孔板，调节细胞浓度，使每孔细胞数为2×105个，将细胞分为：空白对照组、空载纳米粒组、单纯5-FU组、5-FU-PCL-NP组；根据CCK-8实验所筛选出半数有效浓度，按5-FU1.5μg/mL分别加药共培养细胞48h，用不含EDTA的胰酶消化收集收集6孔板细胞，PBS清洗2遍，加入500μL的结合缓冲液悬浮细胞，加入分别5μLAnnexinV，5μLPropidiumIodide混匀；避光，室温下反应15min，后上机检测细胞凋亡率。

1.6统计学处理所有实验均重复3次，统计资料结果以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK法，P<0.05表示差异有统计学意义。使用SPSS19.0软件进行统计分析。

2结果

2.15-FU-PCL-NP形态观察透射电镜照片所示，5-FU-PCL-NP呈现出完好的球形形态，分布均匀无粘连情况，表明成功合成相关载药纳米材料，并且结构稳定（图1）。

2.2空载纳米粒子体外溶血试验体外溶血试验结果显示，阳性对照组出现明显溶血，阴性对照组及2个浓度的空载纳米粒子组均未出现溶血。

2.35-FU载药纳米粒子的体外药物释放体外释药实验结果显示，单纯5-FU在8h内即达峰值；而5-FU-PCL-NP的释放比较平缓，在前24h达50%，在72h后达到62.9%（图3）。

2.45-FU-PCL-NP对Hccc-9810细胞增殖抑制作用单纯5-FU及5-FU-PCL-NP分别按按5-FU药物浓度0、5、10、15、20、40、80μg/mL与Hccc-9810细胞共培养48h之后，细胞活性随药物浓度上升而下降，5-FU-PCL-NP组对细胞的增殖抑制作用明显强于单纯5-FU（P<0.05）。5-FU-PCL-NP组与单纯5-FU组的IC50分别为（1.32±0.12）μg/mL和（2.5±0.39）μg/mL，差异有统计学意义（P<0.05）（图4）。

2.5流式细胞仪检测细胞凋亡率流式细胞仪检测结果显示，空白对照组和空载纳米粒子组凋亡率分别为（6.5±2.4）%、（7.2±3.1）%，两组间差异无统计学意义（P>0.05）；5-FU-PCL-NP组凋亡率为（37.5±4.5）%，而单纯5-FU组细胞凋亡率分别为（26.4±3.2）%，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）（图5）。

3讨论

胆管癌是消化道较常见的恶性肿瘤之一，发病率呈上升趋势，由于其恶性程度高，早期诊断困难，且因其周围解剖结构复杂，容易向周围组织侵润，手术R0切除率低（约15%~20%），预后较差，因此近年来针对胆管癌的非手术治疗逐渐成为研究的热点。

5-FU为治疗消化道恶性肿瘤的经典药物，Thongprasert等报道以5-FU为基础的化疗组患者对胆管癌控制率可达50%。但其治疗剂量较大，为增强疗效而加大剂量会带来毒性作用，临床上患者表现为强烈的化疗后副反应，往往不易耐受。因此通过药物的缓释，减慢药物代谢，增加作用时间窗，提高疗效具有重要的临床意义。

纳米微球由于粒径小、比表面积大，具有特殊的体积效应和表面效应，使之具有特殊的表面性能，包括生物黏附性、电性、亲和性等，这有利于增加所载药物在吸收部位的接触时间和接触面积，加之其对药物具有明显的保护作用，故可大大提高药物的吸收和生物利用度，并可延长其在体内的循环时间，大大增加作用时间窗。聚己内酯材料是一种新型的生物可降解材料，本实验合成了5-FU-PCL-NP，其载药率为15.1%，包封率为41.9%，并通过透射电镜证明了其成功合成，具有稳定的形态，同时体外药物缓释实验结果表明单纯5-FU在前8h即达峰值，而5-FU-PCL-NP的释放在前24h达50%，说明具有一定突释作用，后释放趋于平稳，至72h后达到62.9%，表明该材料具有良好的药物缓释作用。体外溶血试验结果表明，高浓度的纳米材料也不会引起细胞的溶血，证明了其较好的生物安全性。CCK-8增值抑制实验表明5-FU-PCL-NP对肿瘤细胞的增值抑制作用优于单纯5-FU，进一步应用流式细胞仪检测凋亡，结果提示5-FU-PCL-NP明显促进了肿瘤细胞的凋亡，表明载药纳米粒子在细胞吸收后，通过缓释作用，增强了作用时间，促进肿瘤细胞的凋亡增强了药物的杀伤作用。

综上所述，5-FU-PCL-NP具有良好的生物安全性，缓释作用，可以明显增强药物的抑制增殖效果，并能诱导人胆管癌细胞的凋亡。本研究结果为载药纳米给药系统的开发和应用提供了一定的实验基础，为胆管癌的药物治疗提供了新的思路，同时随着后期相关官能团的修饰，可以进一步实现肿瘤的靶向治疗，对于改善胆管癌患者的预后具有重要意义。

纳米粒子篇3

【关键词】 碳纳米粒子；过氧化氢；葡萄糖；电化学传感器

amperometric glucose biosensor based on carbon nanoparticles　wang mei-fang ，zhang wei ，fang bin (college of chemistry and materials，anhui normal university，wuhu 241000)department of chemistry，wannan medical college，wuhu 241000)abstract the nafion/carbon nanoparticles(cnps) composite film modified glassy carbon electrode was prepared by dropwise method，and the electrocatalyst of h2o2 at nafion/cnps modified electrode was investigated.the results show that electrocataytic activitie for detection of h2o2 at the modified electrode is very good.the biosensing application of cnps was demonstrated through fabrication of an electrochemical biosensor.the biosensor was constructed by encapsulating glucose oxidase in the nafion/cnps composite film.the biosensor had good electrocatalytic activity toward oxidation of glucose.the glucose biosensor shows a linear range from 2.0×10－6 to 6.0×10－3 mol/l with a detection limit of 1.6×10－6 mol/l.the biosensor shows high stability，good reproducibility and can avoid the commonly coexisted interference.in addition，real rat serum samples were analyzed by this biosensor with satisfactory results.

keywords carbon nanoparticles； hydrogen peroxide peroxide；glucose； electrochemical biosensor

1 引言

在生物传感器领域，酶电极占有重要地位[1]。但由于酶通常具有较大的分子量，其氧化还原活性中心被厚的蛋白质层包裹，酶的活性中心往往难以与电极发生直接电子转移[2]。通过对电极进行修饰的方法可改善酶的活性中心与电极的作用，实现电子的直接传递[3~5]。在酶传感器中使用纳米材料，不仅可以增加酶的吸附量和稳定性，而且可以提高酶的催化活性，显著提高酶电极的电流响应灵敏度[6，7]。碳基纳米材料，由于其独特的纳米结构，既具有良好的导电性，又能保持蛋白酶的生物活性，使其在生物传感器及生物反应系统中具有极大的应用潜力[8，9]。

碳纳米粒子（cnps）是一种新型的纳米材料，可明显促进生物分子的电子传递作用和生物活性的催化作用。文献[10，11]采用nafion分散碳纳米材料，由于nafion上富含大量的亲水性磺酸基团，具有较好的水溶性，而且nafion膜也具有较好的阳离子选择性和生物相容性[12]，因此常被用于电极表面的修饰和安培型传感器的构建，选用nafion分散碳纳米材料，可有效提高碳纳米材料的分散性，并简化传感器的制作并改善传感器的响应性能。参考文献[13]制备了nafion/碳纳米粒子复合物，并将酶电极技术与纳米技术相结合，研制出nafion/碳纳米粒子修饰的葡萄糖生物传感器。此传感器测量范围、重复性和测量速度等性能都比以往方法有明显优势。碳纳米粒子的这些特性对于提高生物检测的灵敏度和稳定性具有重要意义[14]。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

chi660b电化学工作站（上海辰华仪器公司）；jl-180型超声波清洗仪（上海杰理科技有限公司）；电化学测量采用三电极系统：玻碳电极（φ=3 mm）或修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极。葡萄糖（中国医药集团上海化学试剂公司），h2o2(上海化学试剂公司)，葡萄糖氧化酶（god，sigma公司）； 其它试剂均为分析纯；不同 ph 值磷酸盐缓冲溶液（pbs，25 mmol/l）；实验用水为二次石英蒸馏水；实验在室温下进行。

2.2 电极的处理

将玻碳电极(φ=3 mm) 在金相砂纸上打磨，再依次在 1.0，0.3和0.05 μm 的al2o3悬浊液上抛光成镜面，再在无水乙醇和二次蒸馏水中分别超声洗涤5 min，用氮气吹干，待用。

2.3 修饰玻碳电极制备

参照文献[13]的方法制备nafion/碳纳米粒子复合物，操作如下：将洁净玻璃板置于燃烧蜡烛的上方，收集玻板上的蜡烛烟尘，将0.1 mg烟尘溶解于10 ml 1% nafion乙醇溶液中，超声90 min后，即得到 nafion/碳纳米粒子复合物。以5000 r/min离心 10 min，除去粒径较大的产物。将 10 μl nafion/碳纳米粒子复合物滴涂于处理好的玻碳电极上，待溶剂挥发至干，即制得 nafion/碳纳米粒子复合物修饰的玻碳电极。

将葡萄糖氧化酶加入 nafion/碳纳米粒子复合物中，葡萄糖氧化酶的含量为 5 g/l，向处理好的玻碳电极上滴涂 10 μl nafion/碳纳米粒子/葡萄糖氧化酶复合物，自然干燥后，用 pbs 缓冲液冲洗，制备的酶电极放在 4 ℃的冰箱内保存备用。

2.4 测试方法

电化学实验均在 10 ml 25 mmol/l pbs缓冲溶液（ph 7.4）中进行。实验时，加入适量h2o2或葡萄糖溶液，采用循环伏安法和计时电流法进行测试。循环伏安实验在静止的电解质溶液中进行；计时安培实验在电磁搅拌下进行。待加上操作电压，背景电流达到稳定值后，迅速加入一定浓度的 h2o2或葡萄糖溶液到测量池中，相应的电流变化值作为响应信号。电化学测量均在室温条件下进行。除非特别说明，所有测试的底液均通高纯氮气 20 min 除氧，并在整个实验过程中保持氮气气氛。

3 结果与讨论

3.1 碳纳米粒子的tem，sem表征

图1a为制备的碳纳米粒子tem图像。由图1可见，碳纳米粒子表面包裹着一层nafion膜，制备的碳纳米粒子有良好的分散性，基本没有发生团聚现象，直径在 20~100 nm 范围内。

图1 nafion/碳纳米粒子复合物的透射电镜图（a）和碳纳米粒子的扫描电镜图（b）（略）

fig.1 tem images of resulting nafion/carbon nano-particles(cnps)（a）and sem images of resulting cnps(b)

在4 ℃ 条件下，将 nafion/碳纳米粒子复合物静置10 d仍无团聚现象出现，表明碳纳米粒子在 nafion 乙醇溶液中很稳定。

将nafion/碳纳米粒子复合物用乙醇冲洗离心后所得纯净碳纳米粒子进行sem表征 (图1b)，净化后的碳纳米粒子呈球状，直径为 20~100 nm范围内，与tem观察的结果相符。

3.2 nafion /碳纳米粒子复合物修饰玻碳电极对h2o2的响应

碳纳米粒子具有独特的生物相容性和电化学催化性能。图2为 10 mmol/l h2o2在不同电极上的循环伏安图。实验表明，nafion/碳纳米粒子修饰玻碳电极对 h2o2的循环伏安响应明显增强，还原峰电流显著增高，过电位明显降低，在裸玻碳电极上的h2o2还原电位从－0.35 v 开始，nafion/碳纳米粒子修饰玻碳电极 h2o2还原电位从－0.05 v 开始，过电位降低 300 mv。

实验发现，nafion/碳纳米粒子膜的厚度与 h2o2的修饰量直接相关，因此考察了滴涂不同体积的nafion/碳纳米粒子对电极性能的影响。结果显示，当nafion/碳纳米粒子体积小于10 μl时，电极对h2o2的响应电流会随修饰体积的增大而增大； 而当修饰体积在10 ～15 μl时，电极对 h2o2的响应电流相差不大； 修饰体积大于 15 μl时，电极对 h2o2的响应电流反而减小。这可能是修饰膜较厚，从而使响应电流反而减小。因此 nafion/碳纳米粒子体积选用 10 μl。

在优化条件下进行计时安培测定，图3为 nafion/碳纳米粒子修饰电极在－0.1 v 电位下对0.5 mmol/l h2o2的响应曲线。由图3可见，nafion/碳纳米粒子修饰电极对加入 h2o2产生相当灵敏、快速和稳定的电流反应，电极对 h2o2的响应时间小于 5 s，表明nafion/碳纳米粒子修饰电极对h2o2具有优良的催化还原能力。测定 h2o2的线性范围为 1.0×10－6～5.0×10－3 mol/l，传感器检出限为 1.0×10－6 mol/l。经过21 d后，传感器仍能保持约 90.6%的初始响应电流值。

图2 10 mmol/l h2o2在裸玻碳电极(a)及nafion/碳纳米粒子复合物修饰玻碳电极(b)上的循环伏安图（略）

fig.2 cvs of bare (a) and nafion/cnps modified (b) gc electrode in 25 mmol/l pbs solution at ph 7.4 with 10 mmol/l h2o2vs saturated calomel electrode (sce)

通氮气饱和(saturated with n2)， 扫描速度（scan rate）50 mv/ s。

图3 nafion/碳纳米粒子复合物修饰玻碳电极在 pbs 缓冲溶液(ph 7.4)中的h2o2的电位响应曲线（略）

fig.3 successive amperometric response of nafion/cnps film modified electrode to h2o2 in 25 mmol/l pbs(ph 7.4)

通氮气饱和（saturated with n2）；工作电位(potential)：－0.1 v。 每次加入0.5 mmol/l h2o2(the h2o2 addition each time is 0.5 mmol/l as indicated).

3.3 传感器对葡萄糖的计时电流响应

在最优实验条件下，用计时电流法测定传感器对葡萄糖的响应电流 (图4)。制得的传感器对葡萄糖具有较快的响应时间，在 4 s 内达到稳态电流 95%。在2.0×10－6 ～ 6.0×10－3 mol/l 范围内，响应电流与葡萄糖浓度呈线性关系，相关系数为 0.9786； 检出限为 1.6×10－6 mol/l(s/n＝3)。

3.4 传感器的选择性

图5是在底液中分别加入0.1 mmol/l 葡萄糖，0.2 mmol/l 抗坏血酸，0.2 mmol/l 尿酸，0.2 mmol/l l-半胱氨酸和0.01 mmol/l 葡萄糖的计时电流响应图。可以看到，当加入葡萄糖之后，响应电流迅速增加，并在短时间内达到平衡。而加入大浓度抗坏血酸、尿酸以及l-半胱氨酸后，响应电流值几乎没有发生改变。这是因为 god 对葡萄糖的专一性催化以及 nafion 膜的选择性，使制得的传感器对葡萄糖具有良好的选择性。

图4 传感器在 25 mmol/l pbs (ph 7.4) 含葡萄糖浓度5．0×10－4～6.0×10－3 mol/l的计时电流响应曲线（略）

fig.4 amperometric response of biosensor in 25 mmol/l pbs (ph 7.4) containing glucose from 5．0×10－4 to 6.0×10－3 mol/l

通氮气饱和（saturated with n2）；工作电位(potential)：－0.1 v。

图5 几种干扰物质对葡萄糖测定的影响（略）

fig.5 effect of possible interferents in glucose biosensors

a． 0.1 mmol/l葡萄糖（glucose）；b． 0.2 mmol/l抗坏血酸（ascorbic acid）；c． 0.2 mmol/l尿酸（uric acid）；d． 0.2 mmol/l l-半胱氨酸（l-cysteine）；e． 0.01 mmol/l葡萄糖（glucose）。

3.5 传感器的重现性和稳定性

在葡萄糖溶液浓度为 0.1 mmol/l 时，重复测定 10 次，相对标准偏差为2.8%。实验后将传感器于 4 ℃下悬于pbs 溶液中保存，每隔7 d进行检测，28 d后其响应信号为初始信号的84.6%，表明此传感器具有较好的稳定性。这主要是因为碳纳米粒子具有良好的生物相容性，所制得的nafion/碳纳米粒子复合膜能将god牢固地固定在电极表面，并保持其良好的生物活性。

表1 生物传感器对小鼠血液中葡萄糖浓度测试结果（略）

table 1 analytic results of glucose concentration in rat serum using biosensor

3.6 实际样品测试

用传感器对小鼠血清中的葡萄糖进行检测(见表1)，回收率在98.6%～103.4%之间。结果表明，此葡萄糖传感器的线性范围和灵敏度令人满意，且传感器具有响应速度快、稳定性好、制作简单的优点。可望用于新型葡萄糖生物传感器的制备。

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纳米粒子篇4

【关键词】金纳米棒；耦合；离散偶极近似；消光光谱

【中图分类号】 O463 【文献标识码】 A 【文章编号】1671-8437（2012）02-0003-03

一、引言

纳米尺度的金属粒子所具有的特殊光学及电子学性质使得其在生物传感器、化学传感器、表面增强光谱技术以及光电子、纳电子器件等方面有着广阔的应用前景[1-5]。人们已经证明金、银纳米结构能够表现出强烈的表面等离子体共振效应，而且已经被广泛应用于表面增强拉曼散射衬底。由于纳米结构的等离子体共振对其形状、尺寸、周围介质等因素都有很强的依赖性[6-12]，因此我们可以对特定结构的纳米材料通过改变其结构尺寸参数来调节其等离子体共振峰，使得该共振峰与拉曼光谱的激发波长相同，这样可以产生更强的拉曼信号。

金纳米棒独特、可调的表面等离子共振特性以及合成方法具有简单、稳定、高产等优点，使其在材料学、生物医学以及疾病诊断和治疗等方面的应用越来越广泛。金属纳米材料的线性光学性质受粒子的形状、尺寸、周围介质的介电特性等因素的影响很大，本文则主要从理论上运用离散偶极近似方法研究尺寸对两金纳米棒耦合时的消光光谱的影响作用。这些结果为相关的实验研究提供了有益的理论参考。

二、离散偶极近似原理

离散偶极近似原理：运用离散偶极近似计算任意形状的纳米粒子的光学性质时，是将该粒子视为N个可极化点的立方晶格构成的集合体，而具体哪一个立方晶格被极化并不受限制。我们可以将目标用N个偶极子表达，对于第i个偶极子元素，若其的极化率为ɑ，它的位置在r处，则其极化强度为：

= ɑ（） （1）

（）是该偶极子所在位置的局域电场，它包括入射光电场及其（N-1）个偶极子在该处激发形成的偶极场：

（）=（）+=e-· （2）

为入射光电场的振幅，为入射波矢，大小为k=，

是一个大小为3N×3N表示偶极子作用的矩阵，其形式为：

A·=k××+r-3·（3）

把（2）、（3）式代入（1）式整理后得

A·= （4）

式中，A是矩阵A的转置矩阵，通过解3N个复线性方程组，可以得到每个偶极子的极化强度，从而进一步计算目标粒子的消光截面Cext

Cext=Im*inc，i· （5）

粒子表面的局部电场由入射电场和所有偶极子激发产生的电场组成。

我们应用离散偶极子近似方法计算了金纳米棒棒耦合的消光光谱Qext=，式中ɑeff是纳米结构的有效半径。

三、数值结果

图1给出了金纳米棒棒耦合的结构以及入射电场的偏振方向。金纳米棒截面的直径为d=2R，高度为h，两棒轴线间的距离为L。在本文研究中，入射光是沿着纳米棒的轴线方向传播，其偏振方向垂直于纳米棒的轴线方向。

图1两金纳米棒耦合结构以及入射电场的偏振方向

为了研究不同结构参数的变化对金纳米棒棒耦合的等离子体共振模式所造成的影响，本文在研究时每次只改变一个参数，而固定其它的参数。图2（a）中在固定d=2R=40mm，L=50mm的情况下，将h从40mm增加到65mm，间隔为5nm，其共振消光主峰从λP=0.52319μm（h=40nm）红移到λP=0.55362μm（h=65nm），等离子体共振峰红移了30.43nm。图2（b）中在固定d=2R=40mm，h=60nm的情况下，L从45nm增加到70nm，间隔为5nm，随着两棒间距离L的变化，消光共振峰峰位并没有发生很明显的变化，而消光峰强度有所增大。消光峰强度有所变化，主要是相较于一个棒的情况，两棒间的散射作用明显增强的结果。图2（c）中在固定h=70nm，L=55nm的情况下，R从7nm增加到17nm（间隔2nm）即d从14nm增加到34nm（间隔4nm），消光峰峰位从λP=0.77681μm（R=7nm）蓝移到λP=0.57391μm（R=17nm），等离子体共振峰总共蓝移了202.9nm。图2（d）中在固定h=70nm，两棒外壁间距为10nm的情况下，d从14nm增加到34nm（间隔4nm），L从24nm增加到44nm，间隔为4nm，主峰从λP=0.73623μm（R=7nm）蓝移到λP=0.57391μm（R=17nm），等离子体共振峰总共蓝移了162.32nm。在所有的离散偶极子近似计算中，分割金纳米棒的格子大小为1nm，且此尺寸是满足离散偶极近似的收敛需求的[13]。计算中所用的金块材料介电常数来自实验结果[14]，并且考虑到了纳米结构尺寸对其的影响[15]。

四、结论分析

本文应用离散偶极近似方法计算了金纳米棒-棒耦合结构的消光光谱，系统地研究了金纳米棒-棒耦合结构粒子的结构参数对其等离子体光子学性质的影响。研究结果表明：金纳米棒-棒耦合结构的等离子体共振峰随纵向高的增大而发生红移，且消光峰强度也随之增大；金纳米棒-棒耦合结构的等离子体共振峰随径向直径的增大而发生总体蓝移现象，且消光峰强度随之减小。等离子体共振峰的变化对径向尺寸直径的依赖性比纵向高要大，两棒外壁间距离大小的改变对消光峰峰位的影响不是很大，但消光峰强度是随外壁间距离的增大而增加，这主要是由于两棒的散射作用影响的结果。纳米粒子的量子尺寸效应与表面效应是引起纳米粒子消光峰红移或蓝移的主要因素，而对于金纳米棒-棒粒子的消光峰移动现象则主要是由于表面效应而引起的，随着半径的增大，表面原子数与总原子数的比例随之减小，由于表面效应的影响，使得光谱峰发生蓝移；对于纵向高来说，随着棒的高度的增大，其表面原子数与总原子数的比例增大，所以消光峰峰位发生红移，但是移动幅度较半径变化造成的影响来说要小些。这些结果可以作为设计金纳米棒-棒耦合结构的参考，用来调节其等离子体共振峰，以满足特定等离子体光子学方面的需要。

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纳米粒子篇5

关键词 磁金纳米粒子； 牛血清白蛋白； 结合常数； 荧光光谱

1 引 言

磁金纳米粒子是兼有磁纳米粒子和金纳米粒子优点的复合纳米材料，金包覆的磁纳米粒子（Fe3O4/Au）在水相中分散良好，不易受酸碱腐蚀，在常温下表现出良好的顺磁性，并具有稳定的光学吸收特点，适用于传感器、生物医学等领域 ＼[1，2]。其金表面可以通过静电作用直接与抗体、细胞以及DNA等生物活性分子连接，且有利于保持生物活性。Fe3O4/Au复合粒子的超顺磁性也为样品的分离、富集、固定等提供了方便，是一种理想的载体。

血清白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质[3]。该蛋白质的表面具有多个亲脂性的结合位点，可以与疏水性物质结合，如药物，尤其是具有中性和负电荷亲脂性的化合物[4]。蛋白质和药物的相互作用大大影响药物的生物活性，在药物的药代动力学和药效学中起重要作用[5]。在药物与白蛋白的结合中，非共价的分子间相互作用是主要的结合模式。为了研究非共价分子间相互作用，已经建立了一些方法以计算出结合常数，包括荧光光谱法[6]、毛细管电泳法[7]、色谱法[8]、表面等离子体共振（SPR）[9]、质谱（MS）[10]等。在这些方法中，荧光光谱法和电喷雾电离（ESI）质谱被广泛应用于定量研究。

牛蒡子是植物牛蒡（Arctiin lappa L.）的果实，是一种中草药，其主要活性成分是牛蒡子苷。牛蒡子具有疏散风热，宣肺透疹，消肿解毒，抗胰腺癌等活性[11，12]。

本实验首先合成了Fe3O4/Au纳米粒子，并通过紫外吸收光谱和扫描电镜对其进行表征。由于Fe3O4/Au纳米粒子的超顺磁性和生物相容性，将其作为牛血清白蛋白的载体。在外加磁场的作用下，Fe3O4/Au纳米粒子白蛋白药物复合物与游离药物分离，使非共价结合的白蛋白和药物均从样品溶液中分离出来，消除了药物测定时白蛋白的影响。白蛋白结合在Fe3O4/Au纳米粒子上的量可通过荧光光谱测定在溶液中白蛋白的残余量得到。与白蛋白结合的药物量可以通过荧光光谱测定样品溶液中游离药物的浓度得到。分别测定白蛋白和药物，使二者相互之间没有干扰。基于药物的浓度和白蛋白的量，通过Scatchard方程直接计算得到非共价复合物的结合常数和结合位点数。

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纳米粒子篇6

[关键词]姜黄素； 红细胞； 红细胞膜； 纳米粒子； 抗肿瘤

[Abstract]The objective of this study is to develop a new-type biodegradable， biocompatible curcumin-loaded nanoerythrosomes （Cur-RBC-NPs） by means of the sonication method. The size of Cur-RBC-NPs was optimized by varying drug loading parameters. The morphology， size distribution， stability， in vitro release pattern， cellular uptake of nanoparticles and in vitro anti-tumor effects were evaluated， respectively. The results showed the prepared Cur-RBC-NPs were nearly uniform spheres， with an average diameter of （245.7±1.3） nm. Encapsulation efficiency （EE） and load efficiency （LE） of Cur-RBC-NPs were 50.65%±1.36% and 6.27%±0.29%. And the nanoparticles had a good sustained release property. According to the in vitro experiment， Cur-RBC-NPs were effectively taken in by tumor cells， and exhibited a significant anti-tumor effect. In conclusion， the method for preparing Cur-RBC-NPs is convenient， with a good sustained release behavior and anti-tumor efficacy， and so expected to be a new-type nano-drug delivery system in clinical practice.

[Key words] curumin； erythrocytes； erythrocyte membrane； nanoparticles； anti-tumor

doi：10.4268/cjcmm20161119

姜黄素（curcumin， Cur）是从姜科植物根茎中提取的一种天然酚类化合物。现代药理学表明，姜黄素具有较强的抗肿瘤活性，可以影响肿瘤发生、发展的各个阶段，特别是对肺癌、肝癌、胃癌有着很好的抑制作用[1-2]。但姜黄素不稳定， 水溶性差， 在机体内难吸收， 生物利用度较低，限制了其临床应用[3-4]。

纳米微球载药技术能够提高药物的稳定性，同时又可通过调节和控制药物的释放速度实现长循环的目地，是药物研究的重要领域[5]。以生物材料为基础的纳米载药系统，由于具有生物安全性好等优势，是近年来的一个令人瞩目的新方向。生物材料中红细胞膜纳米载体具有长循环、安全无毒、无免疫原性、可生物降解及生物相容性好等独特优点， 是一种理想的给药系统载体材料[6-7]。因此本实验采用红细胞膜作为药物载体，将姜黄素载入其中。成功制备负载姜黄素的红细胞膜纳米粒子（Cur-RBC-NPs），并对其理化性质和体外抗肿瘤能力进行考察。

1 材料

BI9000AT动态光散射测定仪（Brookhaven，美国）；4802 UV/VIS紫外-可见分光光度计（尤尼克上海仪器有限公司）；LSM 710激光共聚焦显微镜（Carl Zeiss，德国）；P120超声波清洗仪（Thermo Fisher Scientific，美国）；JEM-200CX透视电子显微镜（JEOL，日本）；FreeZone冷冻干燥机（LABCONCO，美国）；5424R离心机（Eppendorf，德国）；BY-600C离心机（北京医疗器械有限公司）；ELX800酶标仪（Biotek， 美国）。AGS人胃癌细胞株（美国模式菌种收集中心）；1640 培养基（维森特生物技术南京有限公司）；小牛血清（杭州四季青公司）；MTT，胰蛋白酶 （碧云天生物技术研究所）；姜黄素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；二甲基亚砜、乙腈、丙酮、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温80，分析纯，南京化学试剂有限公司）。健康人全血（鼓楼医院提供）。

2 方法与结果

2.1 Cur-RBC-NPs制备

2.1.1 红细胞膜制备 参考Jaya A等[8]的制备方法。取健康人抗凝新鲜全血， 加入4 ℃生理盐水洗涤3次，每次洗涤后，3 000 r・min- 1离心6 min， 弃去上清液。然后将沉于底部的红细胞分散于0 ℃低渗（25%）生理盐水中，红细胞在低渗介质中裂解，释放出血红蛋白，12 000 r・ min- 1离心10 min，弃上层血红蛋白，保留底部红细胞膜，重复加入低渗生理盐水清洗红细胞膜至上清液无色。获得淡红色的红细胞膜，放入-20 ℃冰箱保存。

2.1.2 Cur-RBC-NPs 制备 红细胞膜中加入适量生理盐水吹打分散均匀，用超声清洗仪超声10 min（1 130 W，37 kHz，50%功率），即可获得红细胞膜纳米小体，加入姜黄素丙酮溶液，再次超声5 min获得Cur-RBC-NPs。通过离心可以分离出纳米粒子，同时除去溶液中丙酮。

2.2 标准曲线绘制

称取姜黄素10 mg，乙腈中溶解后定容至10 mL，得到姜黄素母液。首先通过紫外分光光度计测得原药在416 nm处有最大吸收峰，再分别取5.0， 10.0， 25.0， 50.0， 75.0 μL母液用乙腈稀释， 定容至5 mL，紫外-可见分光光度计测定其在416 nm处的吸光度。以药物在介质中的浓度C对吸光度a做图， 回归方程a=0.154 3C-0.016 1， R2=0.999， 在1.0～15.0 mg・L-1线性关系良好。

2.3 载药量和包封率测定

用乙腈重复萃取Cur-RBC-NPs中的姜黄素，根据标准曲线法采用紫外分光光度计测定其中药物含量。载药量（load efficiency，LE） =姜黄素质量/（姜黄素质量+红细胞膜质量）×100%。包封率（encapsulation efficiency，EE）=姜黄素实际质量/姜黄素的投料量×100%。

2.4 姜黄素投药量对Cur-RBC-NPs的影响

每800 μL红细胞制备所得的纳米小体为一单位，固定不变。加入不同量的姜黄素丙酮溶液，制备成Cur-RBC-NPs，所获得的纳米粒子的粒径不同，根据粒径选取最佳姜黄素载药参数。加入含有不同质量姜黄素的相同体积丙酮溶液时，Cur-RBC-NPs粒径随药物总量增大而增大；加入姜黄素总药量不变，丙酮用量改变时，粒径随药物体积增大而增大，见图1。以粒径为参考，选择25 μL含有200 μg的姜黄素溶液制得的纳米粒子进行后续实验，此时对应Cur-RBC-NPs粒径为（245.7±1.3） nm，见图2，包封率为50.65%±1.36%，载药率为6.27%±0.29%。

2.5 Cur-RBC-NPs纳米粒子的形貌评价

姜黄素不溶于水，在生理盐水中沉于西林瓶底部。将姜黄素与淡红色透明的红细胞膜纳米小体共同超声，即可将姜黄素包封于红细胞膜纳米小体内部的疏水区域，均匀地分散于生理盐水中。取适量Cur-RBC-NPs溶液，滴至覆有支持膜的铜网上，用滤纸吸走多余的液体，自然晾干后，通过透射电镜（transmissionelectron microscope，TEM）观察粒子形态，见图3。制备的Cur-RBC-NPs纳米粒子呈规则球形结构，粒径在250 nm 左右，与动态光散射仪测定结果一致。

2.6 Cur-RBC-NPs纳米粒子的贮存稳定性

将Cur-RBC-NPs纳米粒子于4 ℃保存，连续一周测定其粒径的变化，见图4，粒子在4 d内粒径无明显变化，粒径均稳定在250 nm 左右，第5天起纳米粒子的粒径开始逐渐增大，提示其在Cur-RBC-NPs纳米粒子可稳定保存4 d左右。

2.7 Cur-RBC-NPs纳米粒子的体外释放试验

将制备好的纳米粒子分散于1 mL生理盐水，加入到透析袋中，然后将透析袋完全浸入10 mL 释放外液（pH 7.4 PBS缓冲液，含0.1% 吐温80）并置于（37±0.5） ℃避光水浴中，分别于0.5，1，2，4，8，12，24，48，72，96，120，144，168 h取出所有释放外液，并补加10 mL新鲜外液。用紫外分光光度计检测释放液在425 nm吸光度，根据姜黄素释放标准曲线A2 = 0.118 3C2 + 0.005，R2 = 0.999（C2为药物在介质中的浓度， A2为吸光度， 特征峰为425 nm），计算姜黄素累积释放量。同时称取相同质量的姜黄素原药作释放曲线进行对比，见图5。姜黄素原药释放迅速，在24 h内即释放了90%药量，而Cur-RBC-NPs药物释放缓慢，在前4 h内粒子释放了约24%负载的姜黄素，随后释放速率进一步减缓，在24，48，120 h分别累积释放了43%，51%，61%。与姜黄素原药相比，Cur-RBC-NPs呈现良好的缓释性能。

2.8 Cur-RBC-NPs纳米粒子的细胞摄取试验

将1 mL（1×105个）AGS 细胞接种于共聚焦小皿中， 培养液为含10%新生牛血清的RPMI1640。培养24 h后， 吸出500 μL培养液， 加入已用细胞膜红色荧光探针（DiI）荧光标记的Cur-RBC-NPs。置于37℃，5% CO2培养箱中共培养1 h后， 弃去培养基， 用37 ℃的PBS冲洗3遍，加入细胞核染色剂（DAPI）继续培养10 min，弃去染液，PBS冲洗后，在共聚焦显微镜下观察AGS细胞对Cur-RBC-NPs纳米粒子的摄取情况。Cur-RBC-NPs与AGS细胞共培养1 h后拍摄的共聚焦图片见图6，蓝色荧光为肿瘤细胞核，在细胞核周围胞质中观察到大量的红色荧光是被肿瘤细胞摄取到核周的纳米红细胞膜载体，绿色荧光为负载在红细胞膜纳米微球内的姜黄素。姜黄素可以通过红细胞膜纳米粒子的细胞摄取作用到达肿瘤细胞内部，从微球中缓慢释放发挥更好的抗肿瘤效果。

2.9 Cur-RBC-NPs的体外抗肿瘤效果

使用MTT法验证纳米粒子的体外抗肿瘤效果。将对数生长期的细胞（1×105）接种于96孔培养板， 培养24 h后， 分别加入质量浓度依次为1，3，10，15 mg・L- 1的姜黄素（原药组）与含有相同姜黄素量的Cur-RBC-NPs （实验组）， 作用48 h后每孔加入20 μL MTT（5 g・L- 1）， 继续培养4 h， 去上清液， 加入150 μL二甲亚砜， 震荡 10 min 用酶标仪于570 nm处测定吸光度。每组设6个复孔， 计算细胞存活率。细胞存活率=A实验组/A对照组×100%。结果见图7，经48 h处理后，Cur-RBC-NPs与姜黄素原药对AGS均呈现出较强的抑制作用，且与剂量正相关，2组抑制结果无明显统计学差异。Cur-RBC-NPs可以被肿瘤细胞迅速摄取增强了其抑瘤作用。且空白的红细胞膜纳米粒子RBC-NPs对细胞没有毒性作用，甚至RBC-NPs混悬液体积占培养液的10%时，仍不影响肿瘤细胞生长，见图8。

3 讨论

姜黄素水溶性差，易分解，在体内难吸收、易经肝肠循环代谢，生物利用度较低，限制了其临床上的广泛应用[9]。本实验以人自体红细胞为原料成功制备了纳米级Cur-RBC-NPs微球，增加了姜黄素的水溶性与稳定性，并且呈现出良好的缓释性能。体外实验中，负载荧光的Cur-RBC-NPs被肿瘤细胞快速大量的吞噬到核周，缓慢释放姜黄素，起到抗肿瘤作用。

MTT结果证实作用48 h后，Cur-RBC-NPs具有显著的杀灭 AGS 肿瘤细胞能力。Cur-RBC-NPs 与姜黄素原药相比并没有显著的抗肿瘤优势，这与两者的作用机制不同相关，姜黄素原药是被动扩散进入肿瘤细胞中，而纳米粒子的摄取方式是胞吞，发挥作用比裸药慢，而且纳米粒子具有缓释性，48 h时只有一半左右的姜黄素被释放出粒子外发挥抑制肿瘤作用，所以体外 MTT 并不表现出纳米粒子的缓释性优势，这与Preeta[10]，Savita[11]等制备的负载姜黄素的高分子微球体外抗肿瘤结果一致。纳米粒子的优势主要体现在显著的体内长循环与靶向能力方面，需要进一步验证其体内抗肿瘤潜能。

传统的高分子材料制成的纳米粒子应用于人体时，经常会诱导人体产生一系列的超敏反应，影响了纳米粒子在临床上的应用[12]。红细胞是自体细胞，作为药物载体具有极高的生物相容性、无免疫原性、可降解性、长循环等独特的优势[13-14]，可以显著地减轻机体的免疫相关反应[15]。但直接以红细胞作为药物载体也有一定缺陷，例如，它不具备纳米粒子的靶向性，且负载的药物释放速率较快[14]。

由红细胞制成纳米级的红细胞膜载体，既保留了红细胞的优势，又兼具纳米粒子靶向性、缓释性等特点[16-17]，为研究者提供了一种全新的纳米给药技术平台。可以预见它在肿瘤治疗等领域具有极大的临床潜力。

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纳米粒子篇7

关键词 石墨烯量子点-银纳米粒子复合物； 类过氧化物酶； 过氧化氢； 葡萄糖

1 引 言

银纳米粒子（AgNPs）是一种重要的纳米材料，在催化、电子和抗菌等领域得到广泛应用。但由于AgNPs易氧化和发生聚集，因此在实际分析应用中一般需加入稳定剂（如聚合物、有机小分子和纳米颗粒等）使其稳定存在[1]。

氧化石墨烯（GO）具有优良的电子、机械和化学性能，已成为构建GO-贵金属新型复合材料中广受欢迎的基本构件。这些GO-贵金属材料在催化[2]、表面拉曼扫描[3]、抗菌[4]、电子运输[5]、制氢[6]、光学和化学传感器[7，8]等领域均表现出优良的性能。在一步光化学反应制备的GO/AgNPs复合物中，AgNPs在GO表面均匀分布，在无外加稳定剂的条件下，GO/AgNPs溶液呈现出良好的分散性及稳定性[9，10]。

石墨烯量子点（GQDs）是尺寸小于100 nm的零维石墨烯纳米片，其量子限域和边界效应带来的优良荧光性能使其在光电子器件、光伏和光发射器件、生物成像、传感和电化学催化等领域广泛应用[11～13]。本研究以GQDs为还原剂，发展了一种在GQDs表面原位生长AgNPs颗粒的新方法，进而得到GQDs/AgNPs纳米复合物。GQDs在充当还原剂的同时，对原位生长的AgNPs表现出良好的稳定作用。此纳米复合物在H2O2氧化3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB）产生显色反应的过程中呈现优良的催化活性，据此构建了一种简单、快速的H2O2和葡萄糖定量检测分析方法。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

H-7650型透射电子显微镜（TEM），工作电压为80 kV； U-3900紫外可见分光光度计（日本日立公司）； LabRAM XploRA全自动显微拉曼光谱仪（法国HORIBA JOBIN YVON公司）。

石墨粉（南京先锋纳米材料科技有限公司）；葡萄糖（Glu）、葡萄糖氧化酶（GOx）、AgNO3、H2O2等（国药集团化学试剂有限公司）。除特别标注外，所有试剂皆为分析纯，实验用水为二次去离子水（18 MΩ cm）。

2.2 GQDs/AgNPs的制备

2.2.1 GQDs的制备 首先根据文献[14]的方法制备GO， 具体过程如下：将10.0 g石墨粉、10.0 g K2S2O8和10.0 g P2O5混匀后，加入30 mL浓H2SO4，80℃反应6 h。冷却至室温后用去离子水洗涤至中性，60℃真空干燥， 得到预氧化石墨。

将5.0 g预氧化石墨与4.0 g NaNO3混匀，冰浴中缓慢加入184 mL浓H2SO4，控制温度在0～4℃之间。缓慢加入25.0 g KMnO4，剧烈搅拌并控制温度在10℃以下；反应1 h后，将体系升温至35℃反应30 min； 室温陈化7天。反应结束后，加入400 mL去离子水，90℃下加热15 min，滴加H2O2至悬浊液由红褐色变为亮黄色。用HCl （1∶10， V/V）充分洗涤至BaCl2检测无SO2 Symbolm4。最后用去离子水洗至弱酸性，60℃真空干燥至恒重，得到GO。

取25 mg GO分散于5 mL去离子水中，与20 mL HNO3 （65%，V/V）混合后转移至聚四氟乙烯密封罐中，200℃微波消解5 min。冷却后旋转蒸发除去未反应的酸，用NaHCO3中和至中性，再用0.22 μm滤膜过滤，收集滤液透析处理（500～1000 MW CO），得到GQDs。

2.2.2 GQDs/AgNPs纳米复合物的制备 将0.5 mg/mL GQDs （100 mL）溶液以氨水调节至中性，并超声20 min。将浓氨水逐滴滴加到1 mL 50 mg/mL AgNO3溶液中，至溶液恰好澄清为止，得到银氨溶液。将上述两种溶液混合，100℃磁力搅拌油浴回流反应1 h，最终得到红棕色GQDs/AgNPs水溶液。

为进行性能比较，研究中以0.5 mg/mL GO溶液取代GQDs溶液，按上述过程制备了GO/AgNPs纳米复合物。

2.3 比色法测定H2O2和葡萄糖

将340 μL HAc-NaAc缓冲液（pH 4.0），100 μL H2O2溶液，12 μL TMB溶液（25 mmol/L）和50 μL GQDs/AgNPs溶液（250 μg/mL）混和摇匀，室温下涡旋振荡反应40 min，在652 nm波长处测定溶液吸光度。

葡萄糖检测时，在葡萄糖样品溶液中加入100 μL GOx，37℃条件下水浴反应30 min。后续检测过程与H2O2检测相同。

3 结果与讨论

3.1 GQDs/AgNPs纳米复合物的制备与表征

本研究中将浓氨水加入AgNO3中得到银氨溶液，Ag（NH3）+2在静电作用下吸附到含有OH和COOH官能团的GQDs表面[9]。在100℃温度条件下，GQDs发生热还原[15]，致使Ag（NH3）+2在GQDs表面转化生成Ag0（NH3）2。生成的Ag0（NH3）2在电子供体NH3的保护下，形成低聚的Ag原子簇，并随时间延长逐渐长大，最后生长成为胶体AgNPs 。

图1A为GQDs的透射电镜图，粒径统计显示GQDs的平均粒径为2～7 nm，与文献[14]报导方法的结果相符。图1B为原位生长AgNPs后的GQDs/AgNPs纳米复合物的透射电镜结果，可以观察到在GQDs表面原位生成了黑色的AgNPs，插图为GQDs/AgNPs的高分辨透射电镜照片，可以清晰地看到AgNPs的晶格结构，晶格间距为0.19 nm，对应Ag纳米晶的200晶面[16]。粒径分布统计结果表明，GQDs/AgNPs纳米复合物的粒径范围为8～30 nm，比GQDs的粒径大，这是因为在GQDs表面生长了一层AgNPs纳米粒子所致。

图2A是GQDs原位生长AgNPs前后的紫外-可见吸收光谱。GQDs在230 nm处有最大吸收，对应芳香环sp2杂化的π-π*跃迁。而GQDs/AgNPs纳米复合材料除230 nm处的吸收峰外，在403 nm处出现新的吸收峰，为AgNPs的表面等离子体共振特征吸收峰[16]，说明AgNPs成功原位生长于GQDs表面。

由GQDs和GQDs/AgNPs纳米复合物的X射线光电子能谱（XPS）全图分析结果（图2B）可以看到，GQDs和GQDs/AgNPs谱图中均有位于284 eV处的C1s峰和532 eV处的O1s峰，但GQD/AgNPs在370 eV附近出现了Ag的特征能谱峰。从Ag3d的高分辨谱图（图2C）可以看出，GQDs/AgNPs纳米复合物中Ag的特征峰分别位于368和374 eV处，对应Ag的3d5/2和3d3/2。这两个峰差值为6.0 eV，与金属形态银的两峰理论差值相符[17]。

GQDs和GQDs/AgNPs纳米复合物的拉曼光谱如图2D所示。GQDs和GQDs/AgNPs在1344和1597 cmSymbolm 1附近均出现D带和G带的特征峰。由于AgNPs的表面拉曼增强效应，GQDs/AgNPs纳米复合物D带和G带强度均明显增强；同时GQDs/AgNPs纳米复合物ID/IG的比值（1.59）远高于GQDs（0.90），说明由于GQDs还原Ag（NH3）+2过程中，GQDs表面含氧基团的消耗和AgNPs的原位生成促使GQDs表面缺陷位点增多，导致其无序程度增大。

3.2 GQDs/AgNPs的催化活性

以过氧化物酶底物TMB为显色底物，H2O2为氧化底物，GQDs/AgNPs为催化剂，通过监测体系中TMB氧化物在652 nm处的吸光度，考察GQDs/AgNPs纳米复合物的类过氧化物酶的催化特性；同时，考察GO/AgNPs的催化特性，H2O2浓度： 0.5 mmol/L； GO/AgNPs和 GQDs/AgNPs浓度： 250 μg/mL。

Concentration of H2O2： 0.5 mmol/L； Concentrations of GO/AgNPs and GQDs/AgNPs： 250 μg/mL.并进行性能比较。GO/AgNPs和GQDs/AgNPs均可催化H2O2氧化TMB产生经典的显色反应，其氧化产物显蓝色，在652 nm处有一个特征吸收峰。GO/AgNPs和GQDs/AgNPs均表现出快速的颜色响应，这是因为石墨烯材料的芳香平面结构和表面羧基基团使其具有较强的类过氧化物酶活性[18]。但在强酸条件下，由GO割裂形成GQDs时，其边缘形成了更加丰富的羧基基团，GQDs因而呈现出更强的类过氧化物酶活性，故GODs/AgNPs在催化氧化TMB时，表现出更灵敏的催化氧化效果，在同样条件下得到更高的响应信号，如图3所示。

催化反应体系的pH值和反应温度对酶催化活性产生决定性影响，本研究对这些影响因素进行了详细考察，结果如图4。当温度高于25℃时，GQDs/AgNPs的类过氧化物酶活性随温度升高而略有下降。在pH 2～4范围内，GQDs/AgNPs的催化性能随pH值增大而增强，但pH 4～6时，随着pH增大，其催化性能急剧降低，并在pH 6时完全失去催化作用。其原因可能是pH过大导致H2O2加速分解。后续研究中选择pH 4.0的HAc-NaAc缓冲液在25℃下进行反应。

为分析GQDs/AgNPs的催化机理，分别通过改变体系中TMB和H2O2浓度测定了显色反应的稳态动力学参数。由图5A和5B可知，GQDs/AgNPs纳米复合物催化反应遵循典型酶催化反应历程即Michaelis-Menten动力学模型。利用Lineweaver-Burk双倒数方程1/V=Km/Vmax（1/[S]+1/Km）计算得到GQDs/AgNPs催化反应的最大反应速率Vmax和米氏常数Km， 如表1所示。GQDs/AgNPs对底物TMB和H2O2的Km与其它报道的类过氧化物酶纳米材料相当，但均远小于HRP。由于米氏常数Km可反映酶与底物之间的亲和性能， Km值越大，亲和能力越弱，反之亦然。上述结果说明GQDs/AgNPs对TMB和H2O2的亲和力较强。

图5C和5D为不同TMB和H2O2浓度时得到的Lineweaver-Burk双倒数曲线。GQDs/AgNPs催化底物H2O2（TMB）显色反应的3条双倒数曲线基本平行。这表明以H2O2（TMB）为底物时，改变TMB（H2O2）浓度，Lineweaver-Burk双倒数的斜率基本不发生变化，只有截距随着TMB（H2O2）浓度的增大而减小。GQDs/AgNPs纳米复合物的催化反应符合乒乓机理[21]，即GQDs/AgNPs先与第一种底物结合并发生反应，且在第二种底物反应之前释放出第一种底物。

3.3 分析应用

基于GQDs/AgNPs纳米复合物的类过氧化物酶催化性质，建立了简单的H2O2比色定量分析方法。由图6A可见，反应生成的蓝色产物的颜色随H2O2浓度的增大而加深。在最优实验条件下，H2O2检测分析的线性曲线如图6B所示，在H2O2浓度0.5～100 μmol/L范围内具有良好的线性关系，检出限为0.18 μmol/L。表2列出了一些纳米粒子作为类过氧化物酶在H2O2检测的分析性能，可以看到， GQDs/AgNPs纳米复合物的检测性能较为优良，同时相较于单一的N-GQDs体系而言，GQDs/AgNPs纳米复合物由于表面AgNPs的原位生成，导致其类过氧化物酶活性更强，因而对H2O2表现更高的检测灵敏度。

基于GOx能够催化葡萄糖产生H2O2，本方法也可用于对葡萄糖的分析检测。图7A为葡萄糖定量分析的标准曲线，在6～200 μmol/L范围内， 葡萄糖浓度与吸光度具有良好的线性关系，检出限为1.6 μmol/L。图7B表明葡萄糖浓度为0.2 mmol/L时，2 mmol/L果糖（Fru）、乳糖（Lac）、蔗糖（Sac）、纤维二糖（Cel）和麦芽糖（Mal）对葡萄糖测定的干扰情况。由于GOx酶催化的专一性，本方法对葡萄糖的检测具有良好的选择性。

Fru： 果糖， Lac： 乳糖， Sac： 蔗糖， Cel： 纤维二糖， Mal： 麦芽糖。

Fru： fructose， Lac： lactose， Sac： saccharose， Cel： cellobiose， Mal： maltose.

将本方法用于人体血清样品中葡萄糖含量的分析测定，结果见表3，测定结果与标准方法的测定结果一致，说明本方法能够应用于实际样品中葡萄糖的检测分析。

4 结 论

以石墨烯量子点（GQDs）为还原剂和稳定剂，在其表面原位生长银纳米粒子（AgNPs），制备了GQDs/AgNPs纳米复合物。GQDs/AgNPs具有优良的类过氧化物酶催化活性，能够快速催化H2O2氧化TMB显色，其催化动力学遵循Michaelis-Menten动力学模型，催化机理符合乒乓机制。GQDs表面和边缘丰富的羧基基团，使GQDs/AgNPs较GO/AgNPs具有更强的催化性能。基于GQDs/AgNPs的酶催化活性建立了H2O2和葡萄糖的比色检测方法，可成功用于血样中葡萄糖的测定。GQDs表面原位生长纳米粒子的方法不仅为纳米粒子的稳定制备提供了一种有效方案，并为进一步拓展GQDs的应用范畴和调控其光学性能提供了新思路。

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纳米粒子篇8

【摘要】

通过交联剂将葡萄糖氧化酶（god）固定在fe3o4磁性纳米粒子上，在磁力作用下将该磁性复合粒子修饰在石蜡碳糊电极（spce）表面，制成易更新酶电极。god催化氧化葡萄糖生成过氧化氢，并使鲁米诺产生电致化学发光(ecl)，据此首次构建了易更新型电致化学发光葡萄糖传感器。其电致发光强度与葡萄糖浓度在1×10－5～1.0×10－2 mol/l范围内呈线性关系，线性回归方程i＝65.4374c+23.9017（r=0.9987）； 检出限为1.0 μmol/l。此传感器响应快， 稳定性高， 表面易更新，已用于测定人血清中葡萄糖的含量。

【关键词】 电致化学发光; 磁性纳米粒子； 葡萄糖氧化酶； 鲁米诺； 化学修饰电极

abstract a novel nano?fe3o4 particles biosensor for glucose based on luminol electrochemiluminescence (ecl) is presented. glucose oxidase (god) was covalently cross?linked to the surface of synthesized magnetic nano?fe3o4 particles. then the composite particles fe3o4/god was adhered to solid paraffin carbon paste electrode by magnetic force to fabricate a working electrode. hydrogen peroxide was produced by enzymatic reaction of god and ecl could be obtained by the reaction between luminol and hydrogen peroxide to construct the renewable glucose biosensor. there was a linear relationship between ecl and glucose concentration in the ranges of 1×10－5－1.0×10－2 mol/l with a regression equation of i＝65.4374c+23.9017(r=0.9987), and the detection limit is 1 μmol/l. the ecl biosensor has showed short response time and high stability, and the electrode surface was renewable easily. the proposed biosensor has been applied to the determination of glucose in plasma samples.

keywords electrochemiluminescence; magnetic nanoparticles; glucose oxidase; luminol; chemically modified electrode

1 引 言

电致化学发光（ecl)是在化学发光的基础上，结合电极反应发展起来的一种化学发光法[1～3]。利用葡萄糖氧化酶（god）催化氧化葡萄糖生成h2o2可以构建葡萄糖ecl传感器。在ecl葡萄糖传感器研究中，god的固定方法是一个重要课题。常用的酶固定化方法有吸附法[4]、包埋法[5]、共价键合法及交联法[6,7]，电化学聚合法［8］。这些方法制备ecl酶传感器过程烦琐、复杂，电极表面敏感膜不易更新。

在酶传感器中采用纳米材料为载体，不仅可以增加酶的固定量和稳定性，而且还可以提高酶的催化活性，进而提高酶电极的响应灵敏度[9]。fe3o4磁性纳米粒子具有纳米粒子的诸多优点，又具有非常好的生物相容性，在外加磁力的作用下能非常方便地实现电极敏感膜的更新，故在酶传感器研究中得到了广泛应用[10～17]。但是在ecl葡萄糖传感器中，使用fe3o4磁性纳米粒子固定god还未见报道。本研究通过交联剂将god共价固定在fe3o4磁性纳米粒子表面，再通过磁力将此固载酶的磁性纳米粒子修饰在spce表面，从而制成了易更新的酶传感器，并用于葡萄糖的ecl分析。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

mpi?e型电致化学发光分析系统（西安瑞迈分析仪器有限公司）; m1703型红外光谱仪（perkin?elmer公司）; 三电极系统：工作电极为自制的磁性纳米粒子固定酶修饰电极（god/fe3o4/spce/cme），参比电极为ag/agcl饱和kcl电极，铂丝为对电极；bransonic200超声清洗仪(德国branson ultraschall公司)；phs?2c型精密酸度计（上海雷磁精密仪器有限公司）。

3?氨基丙基三乙氧基硅烷(aps，98%, alfa aesar公司）；葡萄糖氧化酶(god，120 u/mg，sigma公司）；标准葡萄糖储备液，放置过夜后使用，保存于4 ℃冰箱中。鲁米诺(＞98%，fluka公司）; 戊二醛(25%，上海化学试剂厂）；其它试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水(18.2 mω·cm)。

2.2 酶传感器的制作

2.2.1 固体石蜡碳糊电极的制作

参考文献[13]，取3 cm长的铁棒(外径 2.55 mm)和2 cm长的玻璃管(3.0 mm i.d)，磨平铁棒和玻璃管的两端，用水洗净。按一定比例混合固体石蜡和碳粉，加热熔化石蜡，均匀搅拌，制得石蜡碳糊。把铁棒插入玻璃管中距底部约0.5 mm，形成一个凹坑，趁热将石蜡碳糊封装进此凹坑，填平，冷却，除去玻璃壁外的沾粘的碳糊，并在光滑打印纸抛光电极表面。然后分别用hno3（1∶1， v/v）、无水乙醇和二次蒸馏水清洗电极。在1.0 mol/l h2so4溶液中采用循环伏安（cv）法活化作为工作电极的spce，扫描范围1.2～－1.2 v。再于5 mmol/l k3fe(cn)6溶液中循环扫描，扫描范围改为0.5～－0.2 v。重复上述步骤直至得到峰形良好的一对可逆氧化还原峰。

2.2.2 磁性纳米粒子的制备、氨基化和葡萄糖氧化酶修饰

按照n(fe2+)∶n(fe3+) = 1∶1.75称取适量fecl3·6h2o和feso4·7h2o，溶于水中。搅拌下快速加入适量 2.0 mol/l naoh溶液，调ph值至11.0，室温下搅拌0.5 h，迅速升温到75 ℃，熟化0.5 h，整个过程都在氮气的保护下进行，得黑色悬浮液。超声15 min，磁铁分离不溶物，用水洗涤至溶液呈中性。在75 ℃下真空干燥，得粉末，4 ℃下密闭保存在。

取20 ml乙醇，加入50 mg fe3o4纳米粒子粉末，超声分散，之后加入0.2 ml 3?氨基丙基三乙氧基硅烷（98%），在氮气的保护下，25 ℃搅拌12 h制得氨基化的磁性纳米粒子，用无水乙醇、水超声清洗后定容至20 ml备用。

取2.0 ml上述溶液于5 ml试管中，晾干，再于试管中加入2.0 ml 0.25%戊二醛，混旋30 s后，放入4 ℃冰箱冷藏1 h，之后水洗并晾干，再加20 g/l god溶液2.0 ml，于4 ℃冰箱中保存12 h，制得god修饰的磁性粒子溶液（god/ fe3o4）。图1为磁性纳米粒子固定葡萄糖氧化酶的示意图。

2.2.3 自组装磁性纳米复合粒子修饰电极

spce电极面朝上，用磁铁吸住电极上端铁芯，滴加15 μl god/fe3o4粒子在电极表面，制得酶修饰电极（god/fe3o4/spce/cme）。测定时将电极面对准光电倍增管检测方向。每次更新电极时，移去磁铁，水洗去磁性复合粒子，之后重复上述过程以更新电极。

2.3 ecl传感器原理和实验方法

ecl传感器的原理如图2。god/fe3o4复合磁性纳米粒子通过外加磁场而修饰在spce电极表面。此时，溶液中的葡萄糖与溶解氧发生god酶促反应，生成h2o2。同时，溶液中的鲁米诺在修饰电极表面发生氧化，鲁米诺氧化物与h2o2发生ecl反应。god/fe3o4复合磁性纳米粒子的存在促进了鲁米诺的氧化和h2o2生成。在本实验中，室温下，将10 ml含一定浓度的葡萄糖的0.5 mmol/l鲁米诺? 0.1 mol/l硼酸钠缓冲溶液(ph=8.0)转至石英烧杯中，然后采用三电极系统进行测试，并测定ecl的强度。扫描范围为0.2～1.4 v(vs. sce)，扫速为50 mv/s。光电倍增管高压600 v，采样速率10 t/s，放大倍数3，测量时间60 s。spce不用时置于冰箱中4 ℃下保存。

3 结果与讨论

3.1 fe3o4纳米粒子的表征

3．1．1 fe3o4纳米粒子粒度分析

用激光散射仪（英国malvern公司）测定fe3o4纳米粒子粒径。从图3可见，本实验所制备的fe3o4磁性粒子粒径主要分布在12～22 nm之间。说明磁性纳米粒子已经达到纳米级，且粒径分布较为集中，因此，可用于后续实验。

3.1．2 fe3o4纳米粒子的氨基功能化表征

用红外光谱表征fe3o4粒子表面氨基化修饰前后的变化。由图4可见，在fe3o4粒子表面功能化修饰了氨基基团，fe3o4粒子与氨基化fe3o4粒子都具有fe3o4粒子特征峰（583.235 cm－1）；氨基化fe3o4粒子具有sio的伸缩振动特征峰（1409.675 cm－1）和氨基弯曲振动特征峰（1638.335 cm－1）。

3.1．3 酶复合磁性粒子的磁力测定

用振动样品磁强计(par115型)对移去磁铁而洗脱获得的酶复合磁性粒子进行磁力测量。复合粒子矫顽力较低，同时未见明显的剩磁和磁滞现象，其比饱和磁化强度σ仅为42.1 emu/g（图5）。由此可见，fe3o4 /god复合粒子具有较强超顺磁性即在外磁场存在下有磁性，外撤除磁场则磁性消失，故可用于磁性分离。

3.2 酶电极的ecl行为

fe3o4/god（a）和fe3o4（b）粒子分别修饰的spce，在10 ml含0.1 mmol/l鲁米诺和1.0 mmol/l葡萄糖+0.1 mol/l硼酸钠缓冲溶液(ph= 8.0)中进行cv实验所得到ecl图(见图6)。实验条件：电位扫速为50 mv/s，扫描范围为0.2～1.4 v，采样速率10 t/s，放大倍数3。由图6可见，修饰在电极表面的fe3o4粒子表面成功地共价固定了god，从而催化氧化葡萄糖生成鲁米诺ecl所需的h2o2。

3.3 缓冲液种类、ph值和温度的影响

研究了3种缓冲液: 0.1 mol/l硼酸钠、0.1 mol/l hac?naac和pbs(ph=8.0)作为支持电解质的影响。结果表明，0.1 mol/l硼酸钠缓冲溶液中ecl响应最高。

鲁米诺的ecl反应需在弱碱性条件下进行，考虑到葡萄糖氧化酶的生物活性受ph值影响较大，本研究考察了ph在7.0～9.5时ecl强度的变化。其中鲁米诺浓度为0.1 mmol/l，葡萄糖浓度为1.0 mmol/l。当ph=8.0时，鲁米诺的ecl强度最大，本实验选取ph=8.0。

酶的催化活性受温度影响较大。本实验用集热式恒温加热磁力搅拌器控制水浴温度，考察了20～60 ℃范围内酶电极的电流响应。当温度达到40 ℃时，响应最大。综合考虑温度对葡萄糖氧化酶电极寿命的影响，本实验均在室温25 ℃下进行。

3.4 鲁米诺浓度的影响

本实验考察了鲁米诺的浓度在0.01～1.2 mmol/l范围内对ecl强度的影响（图7）。由图7可知，随着鲁米诺的浓度由0.01 mmol/l增大到0.5 mmol/l时，溶液的ecl强度快速增大，之后趋于平稳饱和。因此，实验中鲁米诺的浓度为0.5 mmol/l。

3.5 葡萄糖的分析

取10 ml石英小烧杯，加入含一系列不同浓度的葡萄糖0.1 mol/l硼酸钠缓冲溶液(ph= 8.0)10 ml，此时鲁米诺浓度为0.5 mmol/l，按上述方法测定ecl的强度（图8）。葡萄糖在1×10－5～1.0×10－2 mol/l浓度范围内与ecl强度呈良好的线性关系：i＝65.4374c+23.9017， r=0.9987； 检出限为1 μmol/l； 酶电极的响应时间约为10 s。

3.6 葡萄糖传感器的重现性、稳定性和选择性

通过移除ecl葡萄糖传感器上方的磁铁，用水冲spce电极表面，在0.5 mol/l hcl中清洗0.5 min，从而去除磁性复合粒子。重复2.2.2节的修饰过程，可实现磁性复合粒子的更新。每次电极更新后对1.0 mmol/l的葡萄糖进行测定，其rsd=3.9%（n=5）。而对于5批次相同条件下制得的传感器，其rsd=4.5%。考察一个月内组装有磁性复合粒子的工作电极对葡萄糖响应情况（不使用时，电极放置在4 ℃冰箱中保存）。结果表明，7天内电极响应基本不变，cv和ecl曲线形状也基本不变；14天后ecl强度约为原来的95%；1月后ecl强度下降85%。显然，用本实验方法固定god在fe3o4纳米粒子表面，能在微环境下保持生物蛋白的活性，从而获得较好的稳定性。

考察了一些常见干扰物质对测定5.0×10－5 mol/l葡萄糖的影响。结果表明，10倍的尿酸和抗坏血酸对葡萄糖的检测的影响均

3．7 临床血清样品测试分析

按照实验方法对人血清样品（桂林理工大学附属医院提供）中葡萄糖的含量进行测定，结果见表1。结果表明，本方法测定结果与医院提供的临床分析结果相吻合。采用标准加入法测定了样品的回收率。表1 人血清中葡萄糖的测定及回收率实验结果（略）

从表1可见，测定结果与参考值基本吻合，回收率在95.2%～104%之间。说明本方法可用于临床样品的测定。

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