被动运动对失神经肌萎缩中Fox03a表达的影响

摘要：目的（1）探索蛋白转录因子3a（fork-head protein。Fox03a）在大鼠失神经肌萎缩中不同时段的表达。（2）探索被动运动对失神经骨骼肌中转录因子Fox03a表达的影响。方法 选54只Wistar大鼠，随机分为空白对照组，失神经对照组和实验组（被动运动组），取各组不同时段腓肠肌样本，测定肌肉萎缩程度并采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）与Western Blot技术分别检测Fox03amRNA和蛋白质的表达量，以GAPDH为内参，分析Fox03amRNA和蛋白质的表达与肌萎缩的相关性。结果 失神经7天、14天和28天组腓肠肌中Fox03a基因和蛋白质表达较正常对照组明显增加，P

关键词：失神经 肌萎缩 被动运动 Fox03a

周围神经损伤发生率和致残率高，臂丛神经损伤所致的手内在肌萎缩的防治是周围神经领域亟待解决的一大难题。骨骼肌萎缩，其本质是一个由复杂基因调控的主动过程。最新研究发现最新研究发现PI3K/AKT/FOXOS信号通路的存在[1]，它是介导肌肉萎缩最关键的分子机制之一，FOXO因子成为连接蛋白合成与蛋白降解的重要桥梁。目前尚无研究证实Fox03a在失神经骨骼肌肉中的表达与及被动运动的相关性。实验旨在观察被动运动对去神经骨骼肌萎缩的防治作用及对PI3K/AKT/FOXOS信号通路中Fox03a表达的影响，为治疗失神经骨骼肌萎缩探索新的有效干预因子。

材料和方法

一、材料

1、动物：健康成年Wistar大鼠，雌雄不拘。

2、主要试剂：RT-PCR试剂盒（MBI公司），Trizol试剂（上海生工生物工程技术服务公司），DNA maker和蛋白maker（Sigma公司），Fox03a多克隆抗体（Cell signal公司）。

二、方法

1.动物分组与失神经肌萎缩模型建立：54只随机分为3组即失神经对照组（A组，24只），治疗组（B组，24只）和正常对照组（C组，6只）。应用10%水合氯醛行腹腔内注射后暴露右侧坐骨神经，实验组大鼠在距梨状肌下孔0.5cm处切断坐骨神经约0.8-1.0cm，近端翻转180°与周围组织缝合，造成右下肢腓肠肌失神经支配模型；对照组行假手术处理。对照组大鼠在术后0天（术后6h），实验组大鼠分别在手术后2天、7天、14天和28天麻醉下分离切取双侧腓肠肌，每次6只，标记后分别称肌肉湿重，提取RNA和蛋白质。

2.被动运动干预方法：被动运动治疗组于手术后第2天起，拉出右后肢，抓住趾部，与脊柱呈45°向后外方牵拉，至右后肢完全伸直，再将右后肢推向身体，使之完全屈曲紧贴身体。每天训练两次，每次屈伸运动300下，每次3min，直至切取标本之日。

3.腓肠肌湿重测定：将双侧腓肠肌自股骨内外髁起点至跟骨结节止点完整取下，用电子天平准确称取肌肉湿重，计算右侧（失神经支配侧）较左侧（假手术侧）腓肠肌湿重的比值。

4、RT-PCR：引物由上海生物工程有限公司设计合成。Fox03a上游引物：5’CTC AGC CAG TGG ACA GTG AA3’；下游引物：5’GCT CTG GAG TAG GGA TGC TG3’。 用Trizol试剂提取不同时段总RNA。根据试剂盒说明书将其反转录合成cDNA。PCR反应产物在2%的琼脂糖凝胶电泳上检测，凝胶成象仪成象。

5、Western Bloting：组织裂解液裂解组织，经5%浓缩胶，12%分离胶进行SDS- PAGE凝胶电泳，将蛋白条带电转移至NC膜上，10%脱脂奶粉室温封闭2h，加入兔抗鼠Fox03a多抗室温反应24h ，TBST洗膜4次，每次15min ，再加入辣根酶标记山羊抗兔IgG二抗室温反应2h ，TBST洗膜4次，每次15min。ECL化学发光法显色，压片、曝光、显影，GS800测量密度扫描仪进行灰度扫描。

6、数据采集和图像分析：使用NIH的ImageJ软件对图像进行分析获取数据，以目的因子与其对应内参扫描灰度的比值作为评价Fox03amRNA和蛋白表达水平的指标。

三、统计学分析：

使用NIH的ImageJ软件对图像进行分析获取数据，结果以均数±标准差（x ± s）表示。采用SPSS13.0统计软件对样本数据进行方差分析，t检验和Pearson相关性分析，P

结果

1.被动运动对骨骼肌形态学的影响

本研究表明大鼠腓肠肌失神经支配后肌湿重比下降，被动运动治疗2天时对肌湿重比无明显影响；术后被动运动治疗组与正常对照组比较，肌湿重比虽降低，但仍高于相同时间点失神经对照组，表说被动运动对抗失神经肌萎缩的效果明显[表2]。

2. 被动运动对失神经腓肠肌Fox03a的表达的影响

对RT-PCR和western bloting数据进行分析，结果（表1）显示早在大鼠腓肠肌失神经2天时，Fox03amRNA及蛋白表达已开始增加，且随着失神经时间的延长持续增加。被动运动治疗7天时，Fox03a mRNA表达显著低与同期对照，此后随着时间的延长其表达水平虽然呈增高趋势，但却始终低于与同期失神经对照组的表达水平，表明被动运动的干预作用对两因子基因表达的作用明显。Fox03a蛋白的变化水平较其mRNA的变化水平低，Fox03a蛋白的表达水平分别在术后治疗7天和14天后开始低于同期对照组，差异均具有统计学意义。

3. Fox03a的表达变化与肌萎缩的关系

对以上数据进行关联性统计分析显示，在失神经对照组中Fox03a mRNA及蛋白与肌湿重比成负性相关关系，表明Fox03a的表达增加与肌萎缩程度有关。此外在被动运动治疗组中，肌萎缩程度，及Fox03a的表达变化对被动运动的干预反应敏感。

讨论

失神经肌萎缩是由多因素、多基因调控的快速发展的主动过程。骨骼肌萎缩的分子机制是一个非常复杂的过程，它涉及到很多复杂的信号通路，如：P13K/ AKT/mTOR/S6K1信号通路、AKT1/FOXOS信号通路、AKT/GSK3/EIF-2B信号通路.骨骼肌在失神经支配后早期出现快速萎缩的事实表明：骨骼肌中蛋白代谢的动态平衡被打破了，蛋白降解超过了蛋白合成[2]。最新研究证实了PI3K/AKT/FOXOS信号通路的存在，PI3K/AKT通路在促进蛋白合成中起非常主要的作用，PI3K与AKT的激活可明显抑制萎缩信号的诱导，使上调的FOXOS 等肌萎缩相关因子表达明显下降。FOXO亚家族的转录因子属于进化保守的转录因子，大约有90个成员，分别是FOXO1、FOXO3a、FOXO4等。Marco Sandri[3]发现其中Fox03a是该家族中的核心，与萎缩密切相关的基因，它几乎在全部的肌萎缩类型都存在。

被动运动肌萎是缩防治的一种有效方法，它可以通过多种作用机制来发挥其肌萎缩的防治机制[4]，本实验证实被动运动可以明显降低Fox03amRNA和蛋白质的表达，说明被动运动防止骨骼肌萎缩的一个重要机制可能是降低Fox03amRNA和蛋白质的表达。如果进一步对的Foxos进行基础研究，我们不仅可以了解其与肌萎缩的内在关系，而且可以在为骨骼肌萎缩的机制研究提供新的思路和方法，为临床药物防治肌萎缩的机制及效果提供研究基础.

参考文献：

[1] Weidong Zhao ，Weiping Qin ， Jiangping Pan ， YongWu ，William A. Bauman，Christopher Cardozo，Dependence of dexamethasone -induced Akt/FOXO1 signaling， upregulation of MAFbx， and protein catabolism upon the glucocorticoid receptor Biochemical and Biophysical Research Commun -ications 378 （2009） 668–672

[2] Amarjit Saini *， Steve Faulkner， Nasser Al-Shanti， Claire Stewart Powerful signals for weak muscles Ageing Research Reviews 8 （2009） 251–267

[3] Marco Sandri，Claudia Sandri，Alex Gilbert，Carsten Skurk，Elisa Calabria， Anne Picard，Kenneth Walsh， Stefano Schiaffino ，Stewart H. Lecker， and Alfred L. Goldberg1，.Foxo Transcription Factors Induce the Atrophy -Related Ubiquitin Ligase Atrogin-1and Cause Skeletal Muscle Atrophy Cell， Vol. （2004）117， 399–412

[4]徐建广，顾玉东，李继峰. 被动活动对失神经支配骨骼肌超微结构及酶组化学影响[J]. 骨与关节损伤杂志，2003，18（1）：27-29.